考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量.docx

考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝G-250法测定蛋口质含量 专业班级:制药工程3班 小组成员：李梦 娴李墩林晓丝一、实验目的 1、 了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 2、 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤 二、实验原理 1、 根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比 色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈 棕红色，当与蛋口质结合后呈青蓝色。在一定范圉内，也就是蛋口质含量在 (TlOOOug范围内，蛋口质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋口质含量成正比， 所以可用比色法测定。 2、 考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。三、仪器与试剂 1、 仪器:分析天平;铁架台；大漏斗;洗瓶;烧杯100ml X2. 50ml X 1 ；吸管 10mlX2、omlXl;胶头滴管;移液枪;离心管10个;722型分光光度计;容量瓶 100ml X 3;洗耳球X 2;玻璃棒;记号笔。 2、 试剂: 蒸懈水。 标准蛋白质溶液:用移液枪吸取1ml浓度为lmg/ml标准蛋白质溶液，溶于 蒸懈水并定容至10ml,制成0. lmg/ml的原液。 考马斯亮蓝G-250(0. 01%)染液:称取0. Olg考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90% 乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸10ml,最后用蒸 镭水定容至100ml (此溶液不宜久存，在常温中可放置广2个月)； 将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。 样品液:用移液枪取lml纯牛奶液体(经调查，市场上 大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2. 5?3. 5g),用蒸憎 水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用 10ml的吸量管吸取10ml —号容量瓶中的液体于—.号100ml的容量 瓶中，最后用蒸憎水定容至100ml,此时二号容量瓶中为待测样品液。 四、操作步骤 1、 0^100 u g/ml标准曲线的制作： 取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中 的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在 595nm下比色测定。以标准蛋白质含量(口 g)为横坐标，吸光度为 纵坐标，绘出标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准液 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 (ml) 蒸憎水(ml) 1. 0 0. 9 0. 8 0. 7 0. 6 0. 4 0. 2 0 考马斯亮蓝染 5 5 5 5 5 5 5 5 液 蛋白质含量 0 10 20 30 40 60 80 100 ( n g) A595 0 0. 303 0. 417 0. 462 0. 549 0. 622 0. 804 0. 906 2、 样品中蛋白质含量测定 另取两支干净的试管(做一重复)，标号A、Bo分别加入lml待测样品液体和 5ml考马斯亮蓝染液，将两支试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测 定方法同上，山样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 标号A B 待测样品液体(ml) 1 1 考马斯亮蓝染液(ml) 5 5 A595 0.451 0.463 蛋白质含量（ug） 五、 数据处理 1、 将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。 2、 计算公式:样品中的蛋白质含量（ug/g鲜重）二｛［查得的蛋口质含量（ug）］ X稀释倍数｝/ ［样品鲜重（g）］ 六、 注意事项 1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时 间内颜色是最稳定的。 2、 测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色 皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用 后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色JIIL决不可用乙醇或丙酮 长时间浸泡。 3、 若选择在漩涡器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消 除。 七、 思考与讨论 1、 制作标准曲线及测定样品时，为什么要将个试管中溶液纵向倒转混合， 答：因为可以使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果 会有很大的偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。 2、 列举儿种常用的蛋口质定量测定的方法，并于考马斯亮蓝染色法相比较各 有何优缺点。 答：1.口前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、 Folin,酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 2.考马斯亮兰法的突出优点是： 灵墩度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1, g。这 是因为蛋口质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋口质，染料复合物有更高的消 光系数，因而光吸收值随蛋口质浓度的变化比Lowr