实验一酵母rna的提取及含量测定(紫外吸收法).pdfVIP

实验一酵母 RNA的提取及含量测定 一、实验目的与要求 1、了解并掌握稀碱法提取 RNA的原理和方法。 2 、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法， 3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 二、实验原理 由于 RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚 法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚 处理并离心后， RNA即溶于上层被酚饱和的水相中， DNA 和蛋白质则留在酚层 中。向水层加入乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去 DNA 和蛋白质。 上述方法提取的 RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取 RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原 料，其工艺比较简单。浓盐法使用 10%左右氯化钠溶液， 90℃提取 3-4h，迅速 冷却，提取液经离心后 ,上清液用乙醇沉淀 RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂 解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA或调 pH 2.5 利用等电点沉淀。 酵母含 RNA达 2.67- 10.0%，而 DNA含量仅为 0.03- 0.516%，为此，提取 RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分 子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（ -C=C一 C=C-），能够强烈吸收 250-280nm 波长的紫外光。核酸（ DNA,RNA）的最大紫外吸收值在 260nm 处。 遵照 Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 1 / 6 在不同 pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之 表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质 时均应在固定的 pH 溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以 ε（ρ）来表示，即每升含有 一摩尔核酸磷的溶液在 260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。 核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的 pH 和离 子 强度发生变化。 RNA溶液（ pH = 7.0）的 ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA的含磷量为 9.5%，含 1 μg /mL RNA溶液的光密度为 0.022- 0.024。因此，测定未知浓度的 DNA （RNA）溶液的光密度 OD 260nm ，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如 核酸 3 μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质 的核酸样品，测定误差较小。 蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收 高峰在 280nm 波长处，在 260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低， 故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 三、主要仪器和试剂 试剂： 啤酒酵母粉、 0.04M NaOH 溶液、 95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液： 30mL 乙醇加 0.3mL HCl。 仪器： 2 / 6 紫外分光光度计、离心机、真空干燥箱、三角瓶、烧杯、水浴锅。 四、实验步骤 1、称取 5g 干酵母粉，用