《乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(pcr荧光法)操作规程》.pdfVIP

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（ 1+2型）核酸检测 试剂盒（ PCR-荧光法）操作规程 1. 目的 规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。 2. 原理 2.1 汇集：吸取 8 份（或以下）样品到指定的汇集管。 2.2 提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。 试剂盒提供之内对照 (IC) 为不具感染性 的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中， 监控提取、扩增和分析的全过程。 标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏， 蛋白质变形， 使病毒裂解释放出病毒 基因组核酸。 加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒， 在高盐环境下带负电荷的核 酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。 洗液可以洗去未结合的物质， 如变性的蛋 白、细胞碎片、 PCR 抑制物等并降低盐浓度。 纯化的病毒在特定的环境下从磁珠 颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。 2.3 扩增：采用 PCR扩增 TaqMan 荧光探针标定技术同时对 HBV （DNA ）、HCV （RNA ）、HIV （RNA ）进行检测。在反转录酶的作用下 HCVRNA 、HIVRNA 反 转录成 cDNA ，再与 HBVDNA 一同通过 TaqDNA 聚合酶的作用扩增病毒核酸的保 守区域， TaqDNA 聚合酶 5` — 3` 外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的 TaqMan 探针，随着 PCR 的进行，荧光信号不断积累。通过 PCR 仪的检测血液标 本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。 选择性 PCR 扩增：采用 UNG-dUTP 抗污染系统。在 PCR扩增系统中采用 UTP代 替TTP ，产生大量 U-DNA 片段。 UNG 酶特异识别 U-DNA 片段中含 UTP 的位点并 进行切割， U-DNA 被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然 的核酸分子，从而防止了 PCR扩增产物的污染。 2.4 质量控制原理 为监控实验进行， 保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质 控品以及内标进行监测。 2.4.1 阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实 验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。 2.4.2 低浓度阳性质控品监控系统假阴性，如果低浓度阳性质控品检测结果为阴 性，说明实验存在假阴性或灵敏度下降的风险， 因此实验中的阴性结果均需复测。 2.4.3 内对照分为 DNA 内对照和 RNA 内对照，是每个反应管中的阳性质控，用 于监控单个反应管中 DNA 与 RNA 的假阴性风险，如果标本检测结果为阴性， 其 DNA 内对照与 RNA 内对照结果必须为阳性，否则提示该标本的扩增受到抑 制，该阴性检测结果有假阴性风险 ，需要复测。 3. 适用范围 适用于核酸实验室采用核酸技术进行的 HBV 、HCV 、HIV 三项单管混样检 测。 4. 职责 4.1 授权的检验人员负责试验操作、结果判读，作好相关记录，对检测结果的真 实性和有效性负责。 4.2 授权的监督人员负责监督该规程执行。 5.原始样品系统 血浆 6.材料与设备 6.1 消耗品 6.1.1 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（ 1+2 型）核酸检测试 剂盒（ PCR- 荧光法），苏州华益美生物科技有限公司； 6.1.2 96 孔深孔板 6.1.3 1.5ml 离心管 （手工实验用）和 2mlAxgen 离心管 （用于配置 PCR 反应液）； 6.1.4 5ml 汇集管； 6.1.5 96 孔扩增板或八连管； 6.1.6 带滤芯并经灭菌处理的