化学发光免疫分析技术.pptVIP

用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 3.1 直接化学发光免疫分析 第三十页，共52页 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 + 抗体 + 带吖啶酯标记物抗体 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 冲洗后 （1） 加入H2O2 （pH10） （2） 加入碱 （pH10） 直接化学发光的机理（夹心法） 第三十一页，共52页 化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme 　immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。 3.2 化学发光酶免疫分析 第三十二页，共52页 该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。 3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 第三十三页，共52页 辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 第三十四页，共52页 该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。 3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 第三十五页，共52页 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 第三十六页，共52页 分析步骤 分配样品, 磁颗粒 和试剂 孵育，使反应物结合 在磁场中清洗去除未结合物质 加入底物 产生信号 孵育,促使信号的产生 信号 检测 第三十七页，共52页 电化学发光免疫 4 Flow cell Fe Oxidized Reduced 第三十八页，共52页 Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA 20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。 ECLIA 电化学 免疫学 化学发光 发光特点：联吡啶钌（标记物+三丙胺自由基（催化）+三角形脉冲电压（激发），0.01ms就可发出稳定的光。 优点：1. 灵敏度高（联吡啶钌再循环），2.检测步骤简化（游离/结合）3.可实现多元检测 4.可实现自动化 第三十九页，共52页 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。 电化学发光免疫分析 Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA 原理 电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁珠技术 第四十页，共52页 电化学发光剂 定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点 反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA） 第四十一页，共52页 ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。 三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点 第四十二页，共52页 [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性； [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的样品种类大大丰富，更重要的是为其检测样品种类的开发前景提供了广阔空间。 三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点 第四十三页，共52页 1电化学反应 2化学发光 3循环 + ECLIA 原理 第四十四页，共52页 常用方法类型 固相磁性微球吸附 采用的固