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高效液相色谱操作知识 （一）高压恒流泵的维护注意事项 泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更 换。应采取下列措施以延长使用寿命： 绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。 每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲 的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。 要用 HPLC 级试剂 输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。 要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。 压力下限应设置在 0.5~1MPa ，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨 有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。 (二)流动相使用的注意事项 必须使用 HPLC 级或相当于该级别的流动相，并要先经 0.45?m 薄膜过滤。 过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如 02 ），如不脱气易产生气泡， 增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 几种脱气方法比较： 1、 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。 2 、 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 3 、 抽真空脱气法：易抽走有机相 4 、 超声脱气法： 一种较为常见的脱气法。 流动相放在超声波容器中， 用超声波震荡 10~15 分 钟，此法效果并不太好但操作简单。 如果管路中使用 peek 树脂部件，请不要使用下列流动相： 浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜 特别注意 HPLC 使用过后的系统清洗： 含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法： 1、 先用 100% 的纯水冲洗，打开排放阀，用 3~5ml/min 的流量，洗二十分钟左右后停泵。 此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗 2 、 再用 5 ：95 的甲醇/ 水清洗整个系统，关闭排放阀，用 1ml/min 的流量，洗 30~60 分钟后停 泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用 5% 的甲醇主要是为了保护色谱柱。 3 、 最后用 100% 的甲醇清洗整个系统，用 1ml/min 的流量，洗 2分钟左右，然后关机。 如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。 (三)流动相的更换 在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的 流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要 特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。 较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种 需更换的流动相都能相溶的流动相。一般清洗时间为 30~40 分钟，直至系统完全稳定。 如不进行以上 “特别注意 ”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。严重时将引起流通池污 染堵塞，不得不更换流通池。用户就要承担不必要的损失了。 储液器的注意事项： 保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用 HPLC 级的溶剂，对试剂含有 缓冲盐及非 HPLC 级的流动相一定要用 0.45?m 过滤器除区去其中的微量物质。 仪操作步骤 1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2 ）、对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。 3 ）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪） ，连接好流动相管道，连接检测系统。 4 ）、 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击 manual ，进入手动菜单。 5 ）、 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的 出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在 manual 菜单下，先点击 purge ，再点击 start ， 冲洗时速度不要超过