流式细胞仪分析技术和应用.pptxVIP

流式细胞仪分析技术和应用第1页/共81页教学目的：掌握流式细胞仪免疫分析的基本原理和技术要点，熟悉其参数与数据显示方式，了解流式细胞仪分选原理。教学要求：1.掌握流式细胞分析技术的基本原理；流式细胞分析术常见术语：前向散射光（FS）、侧向散射光（SS）、流式细胞术定义、荧光补偿和同型对照抗体；流式细胞分析的样本制备，荧光免疫反应、仪器校准和免疫检测质量控制。2.熟悉流式细胞仪的基本组成结构：液流系统、光路系统和数据处理分析系统；流式细胞仪分析软件的数据显示方式及其应用：各种直方图及其设门方式；流式细胞分析仪免疫分析的样本的制备、荧光染料的选择与荧光标记；流式细胞术在免疫学检查中的应用。3.了解流式细胞仪分选原理。免疫胶乳颗粒技术原理及应用。教学重点与难点重点：流式细胞仪分析中不同荧光染料的特点，流式细胞仪检测中不同层次的质量控制要求及流式细胞仪在免疫学中的应用。难点：流式细胞仪免疫分析的基本原理和技术要点。第2页/共81页流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 第3页/共81页流式细胞术的特点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量第4页/共81页流式细胞术发展史1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪第5页/共81页流式细胞术发展史目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司BACKMAN COULTER公司第6页/共81页第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。第7页/共81页第8页/共81页第9页/共81页流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA, RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子, PH值, 膜电位酶活性第10页/共81页一、流式细胞仪分析的工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 第11页/共81页（一）流式细胞仪的基本组成结构：（1） 液流系统（2） 光学系统（3） 数据处理系统第12页/共81页（1）液流系统由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 喷嘴鞘液FluorescencesignalsFocused laserbeam第13页/共81页液流系统示意图第14页/共81页FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）鞘液管样本管第15页/共81页（2）光学系统激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜，将激光器发射的激光束聚焦成椭圆光斑透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS, SS（散射光） FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）FlowTipSS and FLDetectorFS DetectorLaser第16页/共81页光学系统示意图第17页/共81页（3）数据处理系统主要由计算机及其软件组成第18页/共81页（二）基本工作原理硅化管形成稳态水平激光与之已标记的单细胞悬液和鞘液荧光染料被激发发光流动室喷嘴单细胞液