河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)项目申请书《RN.pptxVIP

河科大大学生训练计划（SRTP）;此项目意义何在？其研究对生命科学的研究有何作用？;;PCR扩增五要素;Part1 ;首先我们应该清楚，我们研究的是黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的tap基因，所以我们应该在the website of pubmed上找出tap的完整基因序列。;;然后在the website of ORF finder上找出the sequence of ORF of tap;将得到的部分DNA序列放入primer3软件中得到该序列的引物;正向;反向;tap knockdown by RNAi;Third:RNAi构建;四种限制性内切酶的序列;引物加上酶切位点以及保护碱基以后：引物设计共两种：第一种： LP:GactagtCtcgatacgagcagcaatcac RP: ggatccatcttcaccacttgggttgg(??????)第二种： LP:GCtctagaGCtcgatacgagcagcaatcac RP: CTAgctagcTAGatcttcaccacttgggttgg;Part2.;果蝇DNA的提取和纯化;酚-氯仿抽提法;1. 消化缓冲液;苯酚-氯仿（3:1，V:V） Tris-HCl 饱和 操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。 苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。;实验材料 新鲜存活的果蝇或－20℃冻存1h的果蝇个体5～10个。 实验仪器及用具 器具：玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、4℃冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪头、紫外分析仪、琼脂糖电泳装置。; 药品和试剂 酚（Tris饱和酚）、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸（EDTA）、异丙醇。 溶液配制： 消化缓冲液：含100mM的Nacl，10mM Tris.cl（PH8.0）, 25mM的EDTA（PH8.0）, 0.5％的SDS。 TE缓冲液（PH8.0）：含10mM Tris.cl（PH8.0）,1mM的EDTA（PH8.0）。 电泳缓冲液TAE： 电泳缓冲液（50×TAE）：取Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 0.7％琼脂糖凝胶的配制：称取0.28g琼脂糖，加入40ml 1×TAE，于电炉上加热至沸腾，待凝胶冷却至50℃左右（手试微烫），加入3μl GoldViewTW荧光染料，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。 ;实验步骤 1）取6只麻醉的果蝇（让乙醚挥发干净）放入1.5ml离心管中，加入消化缓冲液30μl，用200μl Tip枪头迅速捣碎。 2）补加消化缓冲液400μl，混匀，置65℃温浴30分钟每10分钟摇荡一次，以使样品被充分消化。 3）取出离心管加入400μl酚，400μl氯仿：异戊醇（24：1）的混合物，盖紧管盖，上下颠倒充分混匀，抽提样品5ml,12000rpm离心5分钟。 4）小心吸取上清转移至新的离心管中。加入400μl异丙醇，轻轻混匀3min，此时可见白色线团状物质出现。 5）14000rpm离心10分钟，让线团状物质沉到管底或管壁，小心倒出液体。 6）用400μl 75％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min,倒掉乙醇，倒置晾干至乙醇味道消失，沉淀用50μl TE 缓冲液溶解。（此时得到的白色线状物即为DNA. 7)取完全溶解后的DNA原液进行1:100稀释，即1μl原液 + 99μl水，混匀。;;;注意事项;Part3.; 模板的浓度应控制在100ng/100 μl 引物浓度应控制在0.1-0.5 μmol/L TaqDNA聚合酶应控制在0.5-2.5U/50 μmol 四种dNTP的浓度应相等 Mg离子的浓度应控制在0.5-2.5mmol/L 配置成相应的PCR反应液。 然后放入PCR仪中扩增，最后将克隆的基因序列保存起来。 ;★PCR检测;★PCR纯化;Part4.;质粒的选择;酶切质粒的去磷酸化; 质粒及目的基因酶切位点的暴露 反应体系： 第一次：A：SpeI B:AvrII 第二次：A：XheI B:XbaI 反应条件：温度37℃，酶切1.5h 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 紫外线投射仪观察结果 UVP凝胶成像系统记录结果 ;质粒及目的基因的连接 将SpeI 内切酶、AvrII内切酶、质粒放入试管1 将SpeI 内切酶、AvrII内切酶目的基因放入试管2. 在37摄氏度