第九章-分子定向进化讲解学习.pptVIP

Crameri等通过DNA shuffling技术来改造砷抗性基因,通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。 Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯复合物的降解特异性区域(qūyù)。尤其是Ile335Phe突变体在提高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶和3,4-双加氧酶的活性。 Keenan等还获得了活性提高11、14、15倍的萘双加氧酶,另外在单加氧酶的功能改进方面取得了较好的进展。 第三十页，共39页。 　3、DNA家族(jiāzú)改组 Crameri等于1998年首次提出“DNA家族(jiāzú)改组”的概念。他们发现,采用传统的DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的,但其中随机产生的多为点突变,且有益突变频率低,导致筛选工作艰巨且进展缓慢。 第三十一页，共39页。 　该技术打破不同种、属间的遗传界限,利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组,通过提高亲本基因群中差异的组合频率和改组子代的杂合度,以增加突变(tūbiàn)文库的多样性,提高突变(tūbiàn)文库的质量,进而有效地产生满足需要的突变(tūbiàn)体。与其他DNA改组技术相比,DNA家族改组技术不仅可以显著加速有益突变(tūbiàn)的累积,还易于实现目的蛋白多种特性的共进化。 第三十二页，共39页。 进行基因组改组首先需要有一个含有各种(ɡè zhǒnɡ)不同正突变的基因组库(例如:通过经典的诱变育种得到目的性状发生改进的不同的正突变菌株就构成了所需的基因组库),随后通过原生质体融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重组,并筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进行下一轮基因组改组,这样,通过循环多轮的随机重组可以快速、高效地选育出表型得到较大改进的杂交菌种。 第三十三页，共39页。 DNA家 族 改 组 的 经 典 技 术 路 线 第三十四页，共39页。 Kumamaru等对P.pseudoalcaligenes KF707的bphA1（联二苯双加氧酶）基因和Burkholderia sp.strain LB400的bphA基因进行了体外分子进化改造,提高(tí gāo)了菌株对多氯联苯的降解能力,还扩大了菌株的降解范围。经改组和筛选获得的bph突变基因在大肠杆菌细胞培养,对乙苯、丁苯和异丙苯降解能力较野生型高。 successful uses 第三十五页，共39页。 Barriault等针对联二苯双加氧酶基因的片段进行改组。其中联二苯双加氧酶的同源基因片段分别来源于Burkholderia sp.,Comamonas testosteroni和Rhodococcus globerulus。研究者在较小的库容内筛选(shāixuǎn)到的新酶不仅对2, 2-二氯联苯、3,3-二氯联苯和4, 4-二氯联苯活力提高,而且对不易分解的2, 6-二氯联苯也具有良好的氧化能力。 第三十六页，共39页。 基因组改组重组几个菌株同源染色体可以提高整个生物体的活性。该方法已用于生物修复中五氯酚的降解，Dai等通过三轮(sān lún)基因组改组将Sphingobilum chlorophenolicum对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培养基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。 第三十七页，共39页。 Vezina等借助DNA家族改组技术探索了苯双加氧酶BPDOs底物的立体专一性和结构之间的关系,获得了对2,2’-CB(2,2’-二氯联苯)中C5和C6的氧化活性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100还能催化2,2’-CB得到顺-5,6-二氧-5,6-二羟基-2,2’-二氯联苯,而且能降解一些其野生型双加氧酶所不能降解的苯、甲苯类单环芳香化合物,扩大了酶的底物范围。 我国的Li等选取15种硝化细菌,对其硝酸氧还酶的同源基因进行家族改组后获得了生长速率加快的克隆(平均(píngjūn)代时16 h-18 h),同时氧还酶的酶活提高10倍以上。 第三十八页，共39页。 复习题 1、酶的定向进化技术的优势是什么？ 2、寡核苷酸知道的诱变方法有几种？ 3、定点突变(tūbiàn)的关键技术是什么？ 4、 DNA改组的优势是什么？ 第三十九页，共39页。 词语：发展 拼音：fāzhǎn 解释：事物由小到大、由简单到复杂、由低级到高级的变化。《孽海花》第二八回：“他们兄弟俩，各依着天赋的特性，各自向极端方面去发展。”毛