动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定.docxVIP

PAGE 2 生物化学实验报告 实验名称：动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定 班级：五班 姓名： 同组同学姓名： 学号： 实验时间：20**.5.28 考评内容 及-不及格 中 良 优 完整程度 20分 现象记录 30分 数据处理 30分 分析讨论 15分 思考题 5分 其它加分 总分： 综合成绩： 评语： 教师签字：  = 1 \* CHINESENUM3 一、实验目的 1.学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术； 2.了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点； 3.学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。 二、实验原理 核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分； 按化学组成可以将核酸分成两大类：① 含脱氧核糖核酸（DNA）； ② 含核糖核酸（RNA）； 在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。 核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、游离。 1.核酸的分离、纯化 分离、纯化原则：保持核酸分子一级结构的完整性；排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ；无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）。 = 1 \* GB3 ①RNA的提取：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核糖核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 = 2 \* GB3 ②DNA的提取：去除RNA后的沉淀物溶解于生理盐水，用去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）使DNA与蛋白质分离开。然后使DNA溶解，氯仿-异戊醇可去除蛋白质，重复操作即得较纯DNA。 2.核酸的测定 核酸是由糖（核糖和脱氧核糖）、磷酸以及含氮碱基（嘌呤、嘧啶）所组成的。测定核酸制品中的糖、磷、氮的含量即可计算出核酸的含量及纯度。（本实验皆是测得糖的含量） = 1 \* GB3 ①RNA的测定：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在20-200μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。 注：地衣酚与戊糖均有反应，DNA及其它干扰物也能给出类似颜色，故测定前尽量去除；地衣酚试剂要使用前配制。 = 2 \* GB3 ②DNA的测定：DNA分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。DNA在40-400μg/mL范围内，光吸收值与 DNA的浓度成正比。 注：乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。 样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA测定。 三、试剂和器材 材料：牛肝 RNA： 试剂：0.14mol/L 、氯化钠 、标准RNA溶液：100μg/mL 、地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂 （现用现配）、80％苯酚溶液、95％乙醇 器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等 DNA： 试剂：生理盐水 、10％SDS、 氯化钠 95％乙醇、 氯仿-异戊醇混合液、 DNA标准溶液：用0.01mol/L NaOH配成200μg/mL溶液 、二苯胺试剂（现用现配） 器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等 五、注意事项 1.RNA最终用2ml去离子水溶解，加样量不变； 2.沉淀和上清避免互相污染； 3.在低温下进行操作；减少物理因素对核酸的机械剪切力；防止过酸、过碱引起核酸降解，4.控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度； 5.所用器械和一些试剂需高温灭菌， 6.提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂，如柠檬酸盐、氟化物、乙二胺四乙酸盐（EDTA）。 7.进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 8.二苯胺反应物及时清洗；地衣酚和二苯胺溶液倒入废液缸； 9.苯酚、氯仿、浓酸：腐蚀性，要注意加入速度；搅拌、震荡过程中，注意密封，试管口不能对人；戴好护目镜、手套；穿长裤。 六、结果讨论 七、工艺图 八、思考题 1.RNA 提取方法有几种？有什么优缺点？ 2.RNA 提取过程中应注意什么？