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CTAB法提取细菌 Total DNA 原理 CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴 化铵 )，是一种阳离子去污剂 ,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的 特性，阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。易溶于异丙醇， 可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高离 子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不 能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉 淀即可使核酸分离出来。 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase活性； NaCl提供一个高盐环境，使 DNP充分溶解，在于液相中 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去 除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质， 有效去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多 糖。 用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时 , 由于 蛋白与 DNA 联结键已断 ,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋 白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点： 1.有效变性蛋白质； 2 抑制了 DNase的降解作用。缺点： 1. 能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA。2.不能完全抑制 RNase的活 性。 1 / 4 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚 -氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚 -氯仿中加少许异戊醇，为 什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张 力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的 水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl或 NaAc （20mmol/L ？ ）Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。 不同生物 DNA 的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处， 可以相互借鉴 [3] 。 在 DNA 提取过程中应做到： 1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性； 2 、尽量排除其它大分子成分的污染 (蛋白质、多糖及 RNA等)； 3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。 核酸的提取关键是去除蛋白质，通常情况下，先用某些蛋白水解酶消化大 部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提，在单价阳离子存在下，核酸在乙醇中形成 沉淀 [20] 。 真核生物中的染色体 DNA 与碱性蛋白（组蛋白）结合，形成核蛋白 （DNP），存在于核内。 DNP在低浓度 NaCl 中，随 NaCl浓度升高，溶解度降 2 / 4 低，但升高到 0.14mol/L 时， DNP溶解度又随着浓度升高而增大，至 1mol/L 氯 化钠中的溶解度比纯水高