PCR技术发展简史 .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR技术发展简史 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT -PCR技术敏捷而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和挺直克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA, mRNA或体外转录的RNA产物。无论用法何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视试验的详细状况挑选随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA, 3种都可。 核酸讨论已有100多年的历史，上世纪60年月末、70年月初，人们开头致力于讨论基因的体外分别技术。Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延长引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传讨论室的Mullis等发明白具有划时代意义的聚合酶链式反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的环境条件，即模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系、DNA变性、复性及延长的温度与时光。Mullis最初用法的DNA聚合酶是大肠埃希菌DNA聚合酶I的Kle-now片段，其缺点是：① Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加入新的聚合酶；②引物链延长反应在37℃下举行，简单发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但因为Klenow酶不耐热，在DNA模板举行热变性时，会导致此酶钝化，每加人一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时光内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶举行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真切性也较高，惟独所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分别的一株水生嗜热杆菌（thermus aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于本来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是本来的60%在95℃下反应2h后其残留活性是本来的40%；②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶；③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增强了扩增长度（2. 0Kb )。因为提高了扩增的特异性和效率，其敏捷性也大大提高。为与大肠埃希菌多聚酶I Klen、片段区分，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase )。此酶的发觉使PCR技术得到了广泛的应用。