PCR检测技术（一） 模板.docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR检测技术（一） 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是进展和普及最快速的分子生物学新技术之一。PCR技术在进展和实际应用中衍生出许多改良技术，如RT-PCR(Reverse Transcription-PCR), PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment length Polymorphism)，多重PCR(Multiple primer-PCR)，不对称PCR(Asymmetric PCR)，P皇家CR-SSCP(Single Strand Conforma-tional Polymorphism)，PCR-ASO(Allela Specific Oligonucleitides)，RAPDP-CR(RandomAmplified Polymorphic DNA)，错配PCR (Mismatched PCR)，原位PCR (in Situ PCR)，实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR )，DDRT-PCR(Differential Display RT-PCR)，免疫PCR等。 (一)PCR原理PCR是依据DNA模板的特性，仿照体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5-3方向掺入单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。囫囵反应过程通常由20～40个PCR循环组成，每个循环由高温变性一低温复性(退火)一适温延长三个步骤组成：高温时DNA变性，氢键打开，双键变成单键，作为DNA扩增的模板；低温时寡核苷酸引物与单链DNA模板特异性的互补结合即复性；然后在相宜的温度下DNA聚合酶以单链DNA为模板沿5-3’方向掺入单核苷酸，使引物延长合成模板的互补链，经过多个变性一退火一延长的PCR循环，就使得DNA片段得到有效的扩增，通常状况下单一拷贝的基因经过25～30个循环可扩增100万～200万个拷贝。最初的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段举行，但Klenow片段在高温下快速失活，因此每一份反应都需要加一份新酶，这不仅棘手，而且还往往导致产量低，浮现产物长短不一等现象。以后人们采纳从嗜热细菌分别的耐热TagDNA聚合酶才解决了这一问题，现在自然?的TagDNA聚合酶或经基因工程重组生产的TagDNA聚合酶在高温下都很稳定，故在囫囵过程中不需要添加新的TagDNA聚合酶，从而使PCR技术快速进展起来。(二)PCR反应体系PCR反应体系主要由引物、dNTP, DNA聚合酶(TagDNA聚合酶)、缓冲液、Mg2+和核酸模板组成。1.引物引物是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸，是打算PCR扩增特异性的因素，引物设计和合成的好坏挺直打算PCR扩增的成败。通常状况下设计PCR引物应遵循以下原则：(1)通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度起码为16个，以20～24个核苷酸为宜，这种长度的引物在聚合温度下(通常为72℃)不能形成非常稳定的杂交体。因为在低温下(37～55℃)TagDNA聚合酶也能作用，所以当寡核苷酸引物退火结合到模板上后，TagDNA就马上开头工作(但TagDNA聚合酶在低温下工作十分缓慢)；当反应的温度升至72℃时，延长后的产物已经足够长，所以能稳定地结合在模板上。引物的Tm值可按式(5-7)举行计算：Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2(℃) (5-7)式中G+C和A+T—碱基数。(2)引物中的碱基应该随机分布，避开在引物中浮现一些单一的碱基重复序列，引物内不能形成发夹结构或产生具有二级结构的区域，引物间不能互补，引物中G+C含量约为45％～55％。(3)在引物5末端可加入限制酶切位点序列以便举行克隆。在酶切位点5末端还应加上适当数量的庇护碱基，以保证扩增反应产物克隆后能够被酶切。假如要使PCR产物能够挺直被限制酶切割，则在设计引物的两端应稍多加几个庇护碱基，否则不易切断，如表5-5所示，比较了各种限制内切酶在其酶切位点旁边分离加0、1、2、3个庇护碱基后的切断状况。寡核苷酸5末端应含有少量不配对碱基，通常并不影响其作为引物的能力。表5-5 PCR产物末端限制性酶切位点的切断状况注：-为不能切断；± 为不能彻低切断；＋为能彻低切断。(4)引物3末端对TagDNA聚合酶的延长效率影响很大。试验表白在扩增HIV(人免疫缺陷病毒)时不同的引物3末端最末一个碱基的错配对扩增效率影响不同，普通引物3末端最好选T，不要选A, G和C。设计简并引物时3末端的简并性应尽量小。