PCR检测技术（三） 模板.docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR检测技术（三） (1)运用化学手段对目标DNA举行提取。(2)设计并合成引物，引物设计或合成的好坏挺直打算PCR扩增的成效。(3)举行PCR扩增。(4)克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产物举行电泳、染色，在紫外光照耀下可见扩增特异区段的DNA带，按照该带的不同即可鉴定不同的DNA。(5)DNA序列分析不同的对象，如扩增DNA片段序列全知、半知或未知，其PCR参数、退火温度、时光和引物等都有较大的差别，部分更组合了RFLP, Sequence和反转录PCR等技术，形成了众多的衍生技术，如多重PCR、定量PCR、竞争PCR单链构型多态性PCR、巢式PCR等，这些技术使PCR在食品中的应用潜力更广。(六)PCR反应的注重事项因为PCR反应敏捷度十分高，所以PCR反应中通常应注重下列事项：(1)预备自己的一套试剂，并少量分装贮藏在无菌工作台附近的专用冰箱内，这些试剂不要挪作他用。配制试剂时应用法未与试验室中其他DNA接触的新玻璃器皿，塑料器皿和移液器、分装的试剂用后即应丢弃，不要重新贮藏。(2)如有可能应在装有紫外灯的无菌操作台中预备和举行PCR。无论何时只要无菌操作台不用，就应打开紫外灯。并将微型离心机、一次性手套、各种用具及用于PCR的各种移液器所有都放在无菌操作台内。因为微量可调移液器的套筒部分往往是污染源，因此应当用带一次性吸头和活塞的正置换移液器吸取试剂。全部缓冲液、移液器吸头及离心管在用法前都应高压灭菌。(3)在打开装有PCR试剂的小离心管前，先用无菌操作台中的微量离心机短促离心10s，使液体沉到离心管底部以削减手套和移液器污染的可能性。(4)在加模板DNA之前最好先将全部其他反应成分加入到微型离心管中，包括加入防止蒸发的矿物油，最后再加入模板DNA，盖好离心管，用戴手套手指轻轻弹打离心管中壁，混合溶液短促离心10s，使有机相与水相分开，然后举行PCR。(5)只要可能应设立一个正对比(即含少量合适目的序列的PCR)，应预先在试验室其他地方预备一份适当稀释的目的序列溶液，以避开将目的DNA的浓溶液带到特地举行PCR的工作区内。同时应设立除模板之外含全部PCR成分的负对比，以便检查反应中是否存在污染的DNA。在工作中常常碰到上一次试验扩增的产物污染下一次扩增反应的状况，利用Perkin El-mer Cetus公司的carryover prevention试剂盒可防止这种污染。该试剂盒的工作原理如下：用dUTP代替dTTP举行反应，由于TagDNA聚合酶同样能利用dUTP举行合成反应，使所得产物中含有dUTP，这种含有dUTP的产物与含dTTP的产物一样可举行杂交、克隆或其他反应，使来自上一轮反应的污染DNA被降解除去。因为UNG作用于单链或双链DNA中的dU，对其他反应底物(包括RNA链中的U和底物中的dUTP)都没有影响，故扩增反应仍可举行。(七)PCR技术在转基因食品检测中的应用PCR技术具有特异、敏捷、自动化、快捷等优点，使其在食品检验中发挥着重要作用，并且有着巨大的进展潜力：目前PCR技术在食品检验中可用于食源性致病菌检测(如沙门菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等的检验)、益生菌检测(如对乳酸菌菌种的鉴定和鉴别等)、动物源性成分检测(如对各类肉制品检测的靶基因主要为真核生物18S rRNA基因和线粒体细胞色素b基因等)、食品真伪鉴定(如通过鉴定大米内参基因而推断蜂蜜中是否掺入大米糖浆等)、食品过敏原成分检测(选取物种特异性基因作为靶基因，如编码大豆植物凝集素Lectin基因、编码玉米植物醇溶蛋白ZEIN基因等)、转基因食品检测等方面，以下就PCR技术在转基因食品检测中的应用举行举例介绍。转基因食品又称遗传修饰食品(genetically modified food)，简称GMF或GM食品。转基因产品的平安性向来是世界各国及联合国等国际组织关怀的焦点，据统计，全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律规矩，转基因产品的讨论、生产、销售都要求在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点举行：对转基因产品的检测管理越来越严格。PCR技术是目前转基因食品检测的主要办法。利用与外源基因序列互补的特定引物对转基因食品中的外源DNA序列举行PCR扩增后分析，不仅可以对转基因食品举行定性鉴别，改良后也可以对转基因成分举行定量分析。1. PC R技术对转基因食品的定性检测目前基于GMO特异外源DNA片段的定性PCR筛选办法已广泛应用于转基因生物及食品的检测，一些国家将此作为本国有关食品规矩的标准检验办法。PCR检测转基因食品的基本步骤：①待检材料DNA提取：通常利用CTAB法从食品材料中提取核酸；② PCR反应：设计合适引物，PCR扩增