PCR扩增产物的检测分析 .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR扩增产物的检测分析 三、核酸探针杂交鉴定法核酸探针杂交法是鉴定PCR扩增产物特异性的一种重要手段。为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交无需举行电泳，挺直对产物举行分析鉴定，还可将样品稀释成 一系列不同浓度，对扩增产物举行定量分析。该法敏捷度较高，特殊适用于特异性不高的 PCR扩增产物分析。其基本过程是将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用发射性或非发射性标志的探针杂交，还可将不同的探针固定到膜上，用标志的扩增产物举行杂交， 称为“反向点杂交法”，该法可同时检测多个突变位点或多种病原体。目前主要用寡核苷酸 探针杂交(ASO)检测点突变。采纳常规的Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测敏捷度可达10ng。基本过程是PCR产物举行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后印迹转移到尼龙膜上，再用 标志的探针举行杂交检测。四、限制性内切酶分析酶切分析是鉴别PCR扩增产物特异性的一种简便办法。按照目标基因的已知序列资料 可以查出包含的酶切位点，用某种限制性内切酶消化扩增产物后举行电泳，观看消化片段的 数目及大小是否与序列资料相符，从而确定产物的特异性。酶切分析的另一种用途是遗传病 的诊断和传染病病原体的基因分型。酶切位点的转变是序列差异的遗传路标，因此可利用高 频率切点的限制酶消化PCR扩增产物，按照限制性片段长度多态性(RFLP)举行目标基因 分析和分型。特异性鉴别可选用识别6个碱基的限制性内切酶，从已知序列资料中查出。基因分型可用识别4个碱基的限制性内切酶，常用的有Alu I、Msp I、Taq I、Hinf I、Mbo l、Dde I、Mse I、BbvI、Mae Ⅲ、Hha I、Rsa I等。五、单链构型多态性分析单链构型多态性分析是一种容易迅速的PCR扩增产物分析办法。其基本原理是双链DNA的PCR扩增产物，变性处理成单链DNA，加样于非变性聚丙烯酰胺凝胶举行电泳，因为DNA在凝胶电泳中的迁移率与其分子量和空间构型有关，在非变性条件下，单链DNA因分子内力作用形成卷曲构型，这种二级结构与单链DNA的序列有关，因此单链DNA的电泳迁移率受到PCR产物二级结构的影响。电泳结束后，单链DNA带在凝胶中位置的差异反映了PCR产物序列的差异。六、PCR扩增产物的挺直测序PCR技术在举行分子克隆和模板制备的大部分工作中显示了极大的优势，它不仅省略了通常制备DNA片段的繁琐步骤，也避开了用法亚克隆的经典程序。结合自动化测序技术，PCR将为了解核苷酸序列信息提供最快和最有效的手段。挺直序列分析是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上，挺直举行基因核苷酸序列分析的办法，是检测基因突变最有 效、最挺直的办法。用于挺直序列分析的办法主要有化学降解法、Taq DNA聚合酶测序法、 三引物法、不对称PCR法等。上一篇：下一篇：