PCR结合寡核苷酸探针杂交方法 .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR结合寡核苷酸探针杂交方法 目前已发觉的大量癌基因中，ras基因讨论得比较细致。ras基因的命名来自大鼠肉瘤(rat sarcoma）的字首，它于1964年首次从大鼠肉瘤的反转录病毒中分别出来，ras基因家族由3个疏远相关的基因组成，即H-ras, K-ras, N-ras。基因在密码子12,13和61发生点突变都能使、癌基因活化产生ras癌基因，从而获得转化潜能。下面以ras基由于例，介绍PCR结合寡核苷酸探针杂交检测办法。 寡核苷酸探针杂交试验是一种能够挺直检测出高分子量DNA中癌基因点突变的办法，操作简便，但敏捷度较低，用于分别DNA的样品细胞中，肿瘤细胞不能少于25%。PCR办法可挑选性地扩增ras基因百万倍，大大提高了试验敏捷度，简化了操作过程。PCR结合寡核苷酸探针杂交，可同时检测大量的病历，敏捷度为5％～10%，使迅速、敏捷地大规模检测各种类型肿瘤的ras癌基因点突变状况成为可能。PCR结合寡核苷酸探针检测、基因点突变试验步骤可分为两步：首先举行PCR反应，使包含ras基因12,13,61位密码子的基因片段放大上百万拷贝；最后用检测ras基因第12,13和61碱基突变的寡核苷酸探针与扩增片段杂交，经严格控制条件的洗膜后发射自显影，检测点突变发生的类型及部位。【材料】1. DNA提取材料及PCR反应材料同上文中基本办法102．寡核苷酸探针杂交材料10x Kinase buffer, γ32 P-ATP (lOu Bq/ul比活3000Bq/mmol),T4 Polynucleotide Kinase、双蒸水、2xSSC,0.1％ SDS。【办法】1. DNA提取 同上文中基本办法1。2. PCR反应 用50ul反应体系lOxPCR缓冲液 5u1dNTP 0.2 mmol/L引物 上下游引物各25 pmol基因组DNA 0.5 ugBSA(100x) 0.5 ul（可不加）DMSO 5 ul（可不加）加水至49 u1，经97℃ 5分钟，加入Taq DNA聚合酶1u1(2U)94℃ 30s55℃ 30s72℃ 30s循环30次后，72℃延长5分钟。取5ul在2％琼脂糖凝胶上检测扩增结果。置于-20℃保存。3．寡核苷酸探针杂交(1)按照样品数量的多寡取合适大小的尼龙膜，当心夹在点样器中。(2）碱变性：10u1 PCR产物加上变性液（4mol/L Na0H,250mmo1/L EDTA-Na2)10ul，加水至100ul，作用5分钟。(3）开动真空泵，取50ul变性PCR产物加入点样孔，边抽气边点样，样品上完后，以100ul2xSSC冲洗点样孔。(4）取出尼龙膜，80℃烘烤2小时，使DNA固定在膜上。(5）按照膜的大小配制预杂交液（含5xDenhardts ,6xSSC,7% SDS和变性鲑鱼精子DNA 100ug/ml)。将膜与预杂交液封入塑料口袋，56℃预杂交2h。(6)寡核苷酸探针的标志：取50～100ng，合成的寡核苷酸探针，加10 x Kinase buffer 2ul、γ32-P-ATP 2～5ul(lOuBq/u1比活3000Bq/mmol) T4 Polynucleotide Kinase 5～10U加双蒸水至20ul,37℃保温90分钟，70℃灭活5分钟，可挺直用于杂交。吸去1/3预杂交液，加入标志好探针，封口后56℃杂交4～20小时。(7）洗膜，取出杂交膜用2xSSC,0.1% SDS,58℃洗涤20小时，边洗边用探测器探测本底计数，以防杂交信号所有走失或浮现假阳性。(8)洗净之杂交膜灯下干燥后，暗室包X线片，按照膜上杂交信号的强弱，发射自显影12～48小时。［注重事项］1．为提高胜利率，应注重基因组DNA的质量，假如因模板的缘由未浮现PCR扩增区带，可取10 ug基因组DNA经稀释后100℃煮沸5～10分钟，然后过Sephadex G-50或G-75柱纯化，可获得惬意扩增效果。2．可以选用混合探针以削减用法不同探针杂交的次数。3．本办法虽然具有迅速、敏捷度高及检测量大等优点，但本办法只能检测已知的突变信息而不能发觉新的突变类型。