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PCR聚合酶及底物——PCR反应体系（二）
底物 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有疏远关系。dNTP溶液具有较强的酸性，用法时应以NaOH将值调至7．0～7．5，分装小管，于-20℃存放，过多的冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTP浓度应在20～200μmol／L，dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增强碱基的错误掺入率和试验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速率的下降，但可提高试验的精确性。4种dNTP在用法时必需以等物质的量浓度配制，以削减错配误差和提高用法效率。此外，因为dNTP可能与Mg2+结合，因此应注重Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系，而且大于200μmol／L的dNTP会增强Taq DNA聚合酶的错配率。假如dNTP的浓度达到1mmol／L，则会抑制Taq DNA聚合酶的活性。 PCR聚合酶 最早用于PCR反应的酶是Klenow酶。因为该酶对高温耐受性差，每次变性时绝大部分酶失活，所以每经过数个循环后则重新添加新酶，致使试验操作复杂化且增强试验成本。以后又分离用法T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，均因其耐热性较差使得这两种酶在PCR反应中的应用受到限制。后来发觉的Taq DNA聚合酶有很高的耐热性(经95℃持续高温仍不失括)，加酶一次可完成囫囵PCR反应。Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，92．5℃时半衰期起码是130min。在不同试验条件下，此酶的聚合酶活性为每秒35～100个碱基。在70℃延长时，链的延长速度每秒可达60个碱基。在100μL PCR反应液中，普通加Taq酶2．5 U，足以达到每分钟链延长1000～4000个碱基。Taq酶除了聚合作用，还具有5’一3’外切酶活性，但缺乏3’一5’内切酶活性，因此不能订正链延长过程中核苷酸的错误掺人。估量每9000个碱基浮现一次错误，而合成41000个核酸可能导致一次框码移位。因为错误掺入碱基有终止链延长的倾向，这就使得发生了错误不会继续扩大。 在100μL反应体系中，普通所需TaqDNA聚合酶的用量为0．5～5U。按照扩增片段的长短及其复杂程度(G+C含量)不同而有所区分。用法Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增；浓度过低则合成产物量削减。不同厂家酶的定义及生产条件不一，可按照详细状况区分用法。 上一篇： 下一篇：
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