VBNC状态细菌数的检验方法 .docxVIP

PAGE PAGE 1 VBNC状态细菌数的检验方法 普通细菌数测定三个指标：总菌数、有生理活性（如醋酶活性、呼吸活性）的细菌数，可培养的活菌数。总菌数包括死菌、VBNC状态的细菌数和可培养的活菌数；有生理活性的细菌数，包括VBNC状态的和可的活菌数。 总菌数用荧光染色挺直计数法测定。现在较多用DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料）测定，其与双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，染色敏捷度比澳化(EB）要高无数倍。也可用EB,SYBRGreenII等多种荧光染料挺直对菌体染色。水中总细菌数用荧光染料叮咤橙测定。这些染料与菌体DNA结合后发出荧光，通过荧光显微镜计数后得总菌数。有生理活性的细菌数测定普通用CFDA（梭基二乙酞荧光素），carboxyfluoresceind-iac-etate,CTC(5-氰-2,3一二甲苯基一四哇盐酸盐，5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium),DVC（挺直活菌计数，directviablecount）等办法。CFDA法用于测定具有醋酶活性的细菌。CFDA被细菌内的醋酶加水分解放出荧光素。细胞经过CFDA染色后有醋酶活性者通过荧光被检测出来。因为CFDA极性较大，不易进入菌体内，因此可以加人EDTA以协助其进人细胞内。在土壤细菌检测中用法含5%氯化钠的磷酸缓冲液配制CFDA，使其终于浓度为100pg/mL.30℃培养1h后可举行测定。CTC用于检验细菌与呼吸作用相关的脱氢酶的活性。CTC与细胞色素系统相偶联，产生甲替。甲替为非水溶性物质，沉积于细胞内，可通过荧光显微镜观看计数。需要注重的是一个细菌体内普通染成2-3个发荧光的点。因此用CTC还原挺直计数法测定的细菌数并不彻低等同于具有呼吸酶活性的细菌数。用法时CTC终浓度为0.05%，同时添加酵母膏20-250tLg/mL和氧化还原辅助剂。DVC法用法蔡咙酮酸等抑制细胞分裂的物质。具有增殖能力的细菌在含少量酵母膏的溶液中因蔡陡酮酸等的作用变得伸长、肥大，再通过荧光染色，利用荧光显微镜对伸长、肥大者计数，达到与不能变大的细菌区分的目的。伸长、肥大者视为有生理活性的细菌。有生理活性的细菌数与可培养的细菌数相减可得VBNC状态的细菌数。活菌计数普通用菌落计数法。