一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法发明专利.docxVIP

一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法 技术领域 本发明属于生物化学方法分析检测技术领域，具体涉及一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法。 背景技术 近年来弛豫核磁共振技术被广泛应用于食品科学、生物检测等领域，但受限于弛豫核磁共振分辨率较低，对样本中小分子含量的微弱变化并不敏感，具体地，应用于液体生物样本中葡萄糖含量的检测时，由于生物样本如血液、唾液、尿液中的葡萄糖水平一般较低，仅有0-30mM，直接进行弛豫核磁共振检测难以准确测定其含量，因此需要设计方法扩大样本中葡萄糖含量不同引起的可检出量。 在本领域中已知的一种检测方法是基于目标诱导的MNP聚集的磁弛豫转换分析，通过经修饰的磁性纳米颗粒（MNP）的特异性吸附，放大葡萄糖引起的液体样本弛豫变化。但在复杂的生物样本中，由于MNP易发生非特异性吸附，不受控制的聚集会严重影响测定的准确性。在此基础上，本领域已提出的另一种解决方法是无MNPs磁性测定法的开发。水溶液中的Fe?3+/Fe?2+可以形成水离子，并且在同浓度的水溶液中，Fe?2+的T?1高于Fe?3+。然而生物样本中除葡萄糖以外的其他物质也存在各种不同类型的氧化还原反应，同样会引起Fe?3+和Fe?2+之间的弛豫转化，极大干扰此检测方法的特异性。 葡萄糖氧化酶与葡萄糖的反应具有高度特异性，而高锰酸钾作为反应产物过氧化氢常用的指示剂，目前还未见其在葡萄糖含量检测中的相关报道。 发明内容 技术问题：本发明的目的在于进一步拓展弛豫核磁共振技术在生物检测方向上的应用，提出一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，更具体地，是以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，并利用有机试剂除去生物样本中原有的蛋白质干扰，通过?1H-NMR弛豫检测高锰酸钾纵向弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量。 技术方案：本发明的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法通过如下技术方案予以实现： 以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，并利用有机试剂除去生物样本中原有的蛋白质干扰，通过?1H-NMR弛豫检测高锰酸钾弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量，该方法具体包括如下步骤： 步骤a.将被测液体生物样本加入无水乙醇或其他具有相同效果的有机试剂混匀后静置，使样本中大蛋白变性沉淀：液体生物样本事先进行预冷，随后加入同样经预冷的无水乙醇或其他有机试剂，充分翻转混匀后在预冷温度下静置，等待发生变性的蛋白质充分沉淀； 步骤b.取上层清液蒸发残留有机试剂：将产生沉淀的样本液进行离心，取出分离的上清液，分为等量的两份记为A、B组，置于干燥箱充分蒸发； 步骤c.将A、B组分别加入标准检测溶液及对照组空白溶液进行反应：A组加入含有葡萄糖氧化酶及高锰酸钾的酸性溶液，空白对照组B组加入只含有等浓度高锰酸钾的酸性溶液，分别混匀； 步骤d.用核磁共振仪器检测A、B组弛豫时间之差：将最终反应完成的A、B组分别取样进行核磁共振检测其弛豫时间T?1、T?2或其他可表征样本弛豫的测量量，两组弛豫时间的差值记为ΔT； 步骤e.根据测得的弛豫时间差与该样本种类已知的数据模型对照得出被测生物样本的葡萄糖含量：将被测液体生物样本的A、B组ΔT作为输入量代入已知的数据模型，得出的输出量即为测得的葡萄糖含量。 其中： 所述被测液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液及含有葡萄糖且质地为液体的生物来源类样本，其中具有一些干扰检测的白蛋白、球蛋白、粘蛋白，在有机溶剂中发生变性，产生絮状或团块状沉淀物。 所述蒸发残留是将液体样本敞口置于干燥箱中直至其中有机溶剂在高于其沸点的环境中蒸发完全。 所述标准检测溶液是将固体葡萄糖氧化酶及高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中。 所述的葡萄糖氧化酶，其含量根据被测生物样本中葡萄糖含量的量级不同而有所区别；所述的高锰酸钾，其含量根据被测生物样本所需的检测上限不同而有所区别。 所述对照组空白溶液是将高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中，终浓度与标准检测溶液中的高锰酸钾浓度一致。 所述核磁共振仪器为满足?1H-NMR弛豫信号测量要求的低场核磁共振仪器，所述取样测量的样本量根据仪器要求有所不同。 所述弛豫时间利用反转回复脉冲序列IR或多回波测量序列CPMG测得。 所述已知的数据模型是对基础成分与被测样本一致，即同属血清、尿液或唾液，并且其葡萄糖含量已知的指定生物样本进行如上步骤的检测后获得的一系列ΔT与对应的葡萄糖浓度联立得到的数据模型，每类生物样本都具有与之对应的不同数据模型。 所述被测样本的检测仪器需与建立数据模型使用的弛豫核磁共振检测仪器一致，具有相同的质子共振频率、测试温度，使用相同的测量脉冲序列、扫描次数、回波间隔的一系列测量参数。 所述已标定葡萄糖浓度的生物样本为基础成分与被测样本一致，如同属血清、尿液或唾液，每类生物样