不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响.docVIP

不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响 1 1材料和方法 2 文2：高碘对桥本甲状腺炎大鼠TRAIL表达的影响 6 1材料和方法 7 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响 文1：不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响 0引言 糖尿病易并发骨质疏松症已被公认, 糖尿病对骨代谢的影响主要表现为骨吸收增加,骨形成减少与缓慢,使骨矿物质含量减少和骨质疏松［1］. 确切的细胞机制尚未阐明. 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand, TRAIL）是新发现的肿瘤坏死因子超家族的成员，可表达于人体的许多组织，对许多肿瘤来源的细胞具有很强的杀伤作用［2-3］，可介导病毒引起的凋亡［4-5］，并在一些自身免疫疾病中起作用［6］. 但在糖尿病骨质疏松发病中是否起作用，目前少见报道. 我们观察不同浓度葡萄糖环境下具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞株中TRAIL及其护骨素（osteoprotegerin, OPG）、护骨素配体（osteoprotegerin ligand, OPGL）的表达情况, 进一步探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制. 1材料和方法 材料第106代MG63细胞株由中南大学湘雅二 医院 代谢内分泌研究所惠赠；MEM培养液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；牛血清白蛋白、Trizol试剂盒（Gibco公司）；逆转录反应试剂盒（Promega公司）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（TaKaRa公司）；引物由北京三博远志公司合成. 鼠抗人TRAIL mAb（本校免疫学教研室）；生物素标记的羊抗鼠IgG抗体（宝泰克公司）；ABC复合物（华美生物工程公司）；DAB（Sigma公司） 方法 细胞培养将第106代MG63细胞株以5×108/L密度接种于培养瓶或制成单细胞悬液接种于预先放置4张7 mm×22 mm盖玻片的培养皿中,用含100 mL/L胎牛血清、50 mg/L维生素C的无酚红MEM培养液,于37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养,2 d 换液1次. 干预试验接种于50 mL细胞培养瓶的MG63细胞达60%~70% 汇片，行细胞爬片的MG63细胞贴壁后即分别换含1 g/L牛血清白蛋白的无血清MEM培养液培养3 h,再分别用含不同浓度葡萄糖的MEM培养液干预,分为4组： 培养基对照组； mmol/L组； mmol/L组； mmol/L组. 干预24 h后,抽提细胞总RNA行RTPCR操作及免疫组化检测. 以上各组实验均独立重复5次. 抽提MG63细胞总RNA. 取2 μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再取1 μL cDNA行PCR扩增OPG， OPGL， TRAIL基因，以βactin基因为内对照. OPG上游引物： 5′AGTGGGAGCAGAAGACATTG3′，下游引物： 5′ATTGGACCTGGTTACCTATC3′，扩增长度为268 bp；OPGL上游引物： 5′GCGTCGCCCTGTTCTTCTAT3′，下游引物： 5′TTGGTGCTTCCTCCTTTCAT3′，扩增长度为598 bp；TRAIL上游引物： 5′GGCATTCATTCCTGAGCAACTT3′，下游引物： 5′GATCTCGTGATCTACCCACCTT3′，扩增长度为908 bp. 反应体系为25 μL，双蒸水18 μL， 10×Buffer μL, Taq酶 μL，上游引物各2 μL，下游引物各2 μL，模板1 μL. OPG反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后延伸10 min. OPGL反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s,55 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s,共30个循环，最后延伸10 min. TRAIL反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s,57 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后延伸10 min. 分别取10 μL PCR扩增产物于含 mmol/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶电泳并拍照，并用凝胶成像分析系统行条带光密度定量检测，测值与βactin光密度值比较，比值表示各指标的mRNA表达量. 免疫组化细胞爬片利用ABC技术进行免疫组化染色，按免疫组化AB