免疫组织化学技术研讨.pptxVIP

免疫组织化学技术;免疫组织化学技术;组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法;组织与细胞材料的制备;切片的制作;目的: 〔1〕防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。 〔2〕使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 〔3〕使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 〔4〕固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 〔5〕防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 〔6〕经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便 于识别。;固定液的选择： (1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中 性缓冲福尔马林 (2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改进Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，参加2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛〔ECG-G〕液 (13)丙酮及醇类固定剂;固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原那么上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。;大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min〔可视观察结果而定〕，石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。 小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min〔肉眼观察〕，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。;切 片;切片： 石蜡切片： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年 冰冻切片： (1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h，冰冻切片。 (2)冰冻切片后需凉干后立即固定 (3)冰冻切片固定后-80℃保存备用;细胞爬片制作;细胞涂片制作;;荧光标记免疫组织化学;酶联免疫组织化学;免疫组化二步法 ;二步法免疫组化染色步骤;;抗原修复方法;微波辐射抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④柠檬酸盐缓冲液〔〕，于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr那么需要20辐射分钟左右。⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。;高压抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。;隔水热抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④切片放入柠檬酸盐缓冲液〔〕中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度到达有效温度后〔92℃↑〕。即开始计时，持续40分钟。⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。;电炉加热抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色