肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2加］i变化及其机制探讨医学.docVIP

肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2加］i变化及其机制探讨医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2加］i变化及其机制探讨医学 1 1材料和方法 2 文2：肺微血管内皮细胞表型改变与博莱霉素所致大鼠肺纤维化的关系医学 5 1材料和方法 6 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2加］i变化及其机制探讨医学 文1：肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2加］i变化及其机制探讨医学 0引言 近年来对肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）发病机制的研究主要集中于多种细胞及细胞因子的相互作用等方面［1］. 但有关肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs） 在PF中作用的研究报道甚少. 中电导钙激活钾通道（intermediate conductance Ca2+activated potassium channel，IKca）对PMVECs膜电位的稳定和细胞内［Ca2+］i 的调节具有重要作用［2］. 博莱霉素（bleomycin，BLM）对组织的损伤具有持续性［3］.我们采用BLM建立大鼠PF模型，利用细胞培养，激光共聚焦技术检测PF时PMVECs内［Ca2+］i的变化，同时检测原代培养PMVECs的中电导钙激活钾通道蛋白质1（intermediate conductance Ca2+activated potassium channel protein 1，IKca1）表达，以期探讨PMVECs在PF发病机制中的作用. 1材料和方法 材料 SD大鼠20只，体质量(150±20) g，雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）；BLMA5粉剂（8 mg/支，批号041103，天津太河制药）；DMEM培养基、胰酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体（北京中山生物试剂公司）；Fura3/AM（美国Molecular Probe公司）； 兔抗IKca多克隆抗体， FITC羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）； IX70型激光共聚焦扫描仪、 光学显微镜、 倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司） 方法 模型的建立 将大鼠随机分为对照组和PF组，每组各10只. BLMA5用生理盐水稀释成4 g/L，按5 mg/kg体质量气管内滴入~ mL.对照组气管内滴入等量生理盐水，2 wk后取肺组织做HE及Masson染色，光镜检查. 培养及鉴定 按 参考 文献 ［4］的方法取大鼠外周肺组织，修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，置于培养液预湿的盖玻片上，孵箱内静置2 h后加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液继续培养， 60 h后去除组织块并换液， 待细胞汇合成单层后取出备用. 倒置显微镜下观察， 抗Ⅷ因子抗体免疫细胞化学染色鉴定. 实验及鉴定均采用原代细胞. ［Ca2+］i检测 PBS洗3次，加入100 μL Fluo2/AM工作液，孵育40 min，PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光强度. 间接免疫荧光染色 细胞爬片乙醇固定，染色步骤按试剂盒说明进行. 兔抗IKca1多克隆抗体及FITC羊抗兔IgG工作浓度分别为1∶15，1∶32，空白对照用PBS代替一抗，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察. 免疫细胞化学染色 细胞爬片冷丙酮固定，染色步骤按试剂盒说明进行(SABC法)，兔抗IKca1多克隆抗体工作浓度1∶30. 采用计算机图像分析后苏木素轻度复染，脱水，透明，封片. 统计学处理: 应用SPSS 软件，两组均数比较采用t检验，P为差异有统计学意义. 2结果 肺组织光镜观察 HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚；PF组部分肺泡腔消失，肺泡壁明显增厚，其中可见胶原纤维沉积；Masson染色对照组肺泡组织结构完整，肺间质中可见少量染成蓝色的胶原纤维；PF组肺组织结构紊乱，可见大量胶原纤维沉积于肺间质内. 鉴定 原代培养的内皮细胞呈铺路石样从组织块边缘爬出，透光性好，周边可见少许成纤维细胞（图1A）.Ⅷ因子免疫细胞化学染色见细胞胞浆内呈棕黄色染色（图1B） ［Ca2+］i测定 游离Ca2+主要位于内皮细胞胞质内. PMVECs内［Ca2+］i对照组为±，PF组为±，两组比较差异具有统计学意义（n=9，t=，P，图2） 表达 IKca1主要在细胞膜上表达. 计算 机图像分析平均灰度值对照组为± （n1=83）， PF组为± （n2=88）， 两组比较差异具有统计学意义（t=， P