诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响医学.docVIP

诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响医学 1 1材料和方法 2 文2：丹参酮ⅡA对人胃癌MKN45细胞增殖及基质金属蛋白酶2表达的影响 6 1 材料与方法 7 2 结果 9 3 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响医学 文1：诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响医学 E2F最初作为腺病毒（adenovirus, Ad）E2启动子的活化因子被发现［1］，它是细胞周期调控过程中起重要作用的转录因子，E2F调控异常存在于多种肿瘤细胞中［2］．靶向E2F转录因子是肿瘤基因 治疗 的策略之一．目前在治疗多种肿瘤的体内外动物实验中均取得了良好效果，包括非小细胞肺癌、胃癌及乳腺癌等［3-4］. op18（又称oncoprotein18, stathmin）是一种高度保守的细胞内蛋白，该蛋白在恶性肿瘤发生、 发展 及决定表型上具有重要作用及意义［5］． Polzin等［6］发现op18基因启动子上有E2F的结合位点，说明op18基因是转录因子E2F调控的靶基因，但截至目前E2F对op18基因的具体调控机制仍未阐明. 本实验应用诱骗寡核苷酸（decoy oligodeoxynucleotides, Decoy OD）策略来研究转录因子E2F对op18基因表达及肿瘤细胞的生物学行为影响，初步探讨E2F对op18基因的调控，旨在为肿瘤的生物治疗寻找新的技术方法． 1材料和方法 材料 MKN45细胞（人低分化胃癌细胞株）唐都 医院 中心实验室保存；TRIzol，LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司）；Taq DNA聚合酶，DGL2000 DNA Marker(北京鼎国生物技术有限公司)；DMEM培养液，1640培养液(GIBCO公司)；T4 DNA连接酶(Promega公司)；所有PCR扩增引物及E2F Decoy序列均由上海英骏生物工程公司合成；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司) 方法 基因Decoy 寡核苷酸设计合成及实验分组 根据Polzin等［6］提供的op18基因启动子上E2F的结合位点序列， 参考 文献 ［7］的方法，合成哑铃形Decoy OD，序列如下：EOP1：5′GGATCCCTTTCCCGCACAGGAAAACCTGTGCGGGAAAG3′，EOP2：5′GGATCCTTTGGCGGG AGTTAAAAAACTCCCGCCAAA3′，EOPm(突变对照）：5′GGATCC TTTGGCG AACGTTAAAAAACGTTCGCCAAA3′. 斜体部分为op18基因启动子上E2F的结合位点，框内部分为loop，下划线部分为BamHI酶切位点. EOPm的序列是将E2F的结合位点序列进行了突变，作为突变对照．应用梯度退火的方法使合成的序列形成哑铃形的结构．取退火产物4 μL，用T4 DNA连接酶做连接，体系条件按该酶说明书（图1）．根据实验要求分为五组： EOP1组：转染EOP1 Decoy OD的MKN45细胞；EOP2组：转染EOP2 Decoy OD的MKN45细胞；EOP1+EOP2组：转染EOP1和EOP2 Decoy OD的MKN45细胞；EOPm组(突变对照）：转染EOPm Decoy OD的MKN45细胞； 脂质体介导E2F基因Decoy OD的细胞转染 转染前1 d，在100 mm平皿中按×105细胞/皿接种MKN45细胞．脂质体转染操作步骤按LipofectamineTM2000说明书进行．于转染后8 h换为完全DMEM培养液继续培养72 h，分别收集各组的MKN45细胞进行功能研究． PCR检测 转染细胞op18基因的表达收集不同组的MKN45细胞，分别用TRIzol 法提取细胞总RNA．取5 μg总RNA，加入1 μL oligo(dT), 按照逆转录试剂盒操作说明，合成cDNA第1链，以反转录的cDNA为模版，常规PCR扩增op18基因．op18基因引物序列如下，上游引物：5′TACCGAAGAAGACTATAGGT3′；下游引物：5′AATCAGTCGAAGTCAGAGCA3′，片段大小450 bp．用βactin基因做为内参照，引物序列如下，上游引物为（6888）：5′ATGGATGATGATATCGCCGCG