融合蛋白HSP70EGFP的表达纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用医学.docVIP

融合蛋白HSP70EGFP的表达纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：融合蛋白HSP70EGFP的表达纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用医学 1 1材料和方法 2 文2：存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达 7 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 16 正文 融合蛋白HSP70EGFP的表达纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用医学 文1：融合蛋白HSP70EGFP的表达纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用医学 热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发肿瘤疫苗具有重要意义. 许多研究采用标记的热休克蛋白观察 HSP肽复合物在抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）上的呈递过程，发现 APC 表面存在 HSP 受体［1-2］. 有研究发现，gp96融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞（dendritic cells，DCs）分泌IL12和TNFα，增强其抗原递呈能力［3］. 而对热休克蛋白70（heat shock protein, HSP70）融合蛋白在抗原递呈细胞上的递呈过程的研究报道较少. 我们设计了HSP70和具有示踪功能的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP，以探讨DCs内化外源性抗原的方式及不同抗原对DCs的活化效果. 1材料和方法 材料 新鲜全血由健康志愿者提供；质粒pIRES2EGFP（美国Clontech公司）；原核表达载体pET28a(+)HSP70由第四军医大学病 理学 教研室陈广生博士构建；NiNTA 树脂（美国Novagen公司产品）；rhIL4，rhIL2（美国RD生物工程公司产品）；rhGMCSF由厦门特宝生物工程公司生产；鼠抗人McAbCD1a，CD80和HLADR（美国Sigma公司）；羊抗鼠IgGFITC（武汉生物制品公司）；人IL12 Elispot系统（法国DIACLONE公司产品）；蛋白HSP70，MAGE1由第四军医大学病理学教研室惠赠；蛋白EGFP的制备按 文献 ［3］的方法进行. 方法 载体的构建 根据EGFP的基因序列，设计引物，用PCR技术从质粒pIRES2EGFP中扩增EGFP，上游引物为：5′ CCT GAG CTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG 3′，下游引物为：5′ GCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G3′，分别包含了SacI和XhoI的内切酶位点(划线部分). 将EGFP基因克隆到pET28a(+)HSP70原核表达载体上，与HSP70基因融合，转化 DH5α宿主菌，挑取单克隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳. 融合蛋白的表达 将重组质粒转化入 BL21(DE3)，用卡那霉素筛选. 培养含有HSP70EGFP融合基因的BL21大肠杆菌至对数生长期，加入IPTG至终浓度 mmol/L，4℃ 诱导表达12~18 h，收菌. SDSPAGE分析融合蛋白的表达. 融合蛋白的分离与纯化 用50 mmol/L磷酸缓冲液+300 mmol/L NaCl， pH ，充分悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清变性蛋白. 用22 μm滤膜过滤，Ni离子亲和层析柱层析，250 mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰. SDSPAGE分析纯化蛋白. 树突状细胞的培养 采用文献［4］的方法分离、诱导及分化外周血中的DCs. 在培养的不同阶段收集悬浮细胞，在光镜下观察细胞的形态，用流式细胞仪检测DCs表型. 内化实验 实验分为三组，每组含1×106 DCs，孵育蛋白浓度为100 mg /L. 将1，2组DCs分别与EGFP和HSP70EGFP于4℃孵育30 min；第3组DCs先与HSP70在4°C孵育30 min，洗涤3遍，再将DCs与HSP70EGFP在4℃孵育30 min. 之后将三组DCs转至37℃，50 mL/L CO2孵箱内，分别培养，1，2和24 h. 流式细胞仪检测胞内含EGFP的DCs数量，阴性对照组除孵育蛋白为MAGE1外，其余各项同1，2组. spot 检测 用人IL12 Elispot系统（Human IL12 Elispot system）检测活化成熟后释放IL12的DCs细胞频数. 依刺激物不同，分别为：1 mg/L LPS；95℃ 灭活10 min的1 mg/L LPS；10 mg/L HSP