苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγcaveolin1表达的影响医学.docVIP

苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγcaveolin1表达的影响医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγcaveolin1表达的影响医学 1 1材料和方法 2 文2：单核细胞源性泡沫细胞TREM1的表达 5 1 材料与方法 6 2 结 果 8 3 讨 论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγcaveolin1表达的影响医学 文1：苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγcaveolin1表达的影响医学 0引言 动脉粥样硬化一个重要的特征是单核细胞进入损伤的动脉壁进而分化为巨噬细胞. 这些巨噬细胞吞噬大量的脂质变为泡沫细胞［1］. 在人类和小鼠粥样斑块损伤中可见过氧化物酶增殖物激活受体(PPARγ)明显表达，提示PPARγ在动脉粥样硬化中起重要作用. 小凹蛋白1(caveolin1)具有结合和运载胆固醇的功能,并促进细胞内游离胆固醇流出,对维持正常细胞胆固醇的稳态起着重要调节作用［2］. 苦参中的活性成分苦参碱（Matrine）具有较为广泛的生物学作用［3］. 但其抗动脉粥样硬化的机制目前尚不清楚. 本实验我们以oxLDL诱导的单核细胞形成的泡沫细胞为实验模型,观察苦参碱对胆固醇脂,PPARγ,小凹蛋白1表达的影响，进一步探讨苦参碱在动脉粥样硬化发病机制中的作用. 1材料和方法 材料RPMI 1640培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自天津市正江高科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA), 佛波酯（PMA）, 油红O, 靛蓝胭脂红, 胆固醇氧化酶, 胆固醇酯酶均购自Sigma公司；胆酸钠美国Amresco公司. 胆固醇购自GourMet Cell Application公司；苦参碱(一种生物碱,具有四环的喹嗪啶类结构，熔点~℃,纯度99%, 溶于水),批号为，分子质量，宁夏中药厂提供. 方法 健康人血浆购自宁夏中心血站，按照常规方法分离、提纯，提取的LDL以含 g/L EDTA的TrisHCl缓冲液(pH ) 4℃透析48 h,过滤除菌,考马斯亮蓝G250法定量蛋白. 在分组干预时，使苦参碱终浓度达到以下分组的浓度［4］：①对照组：对细胞没有任何干预；②oxLDL+PMA组：培养细胞中加入终浓度为 mg/L的PMA, 100 mg/L的oxLDL; ③苦参碱低剂量组：培养细胞中加入终浓度为 mg/L的PMA, 100 mg/L的oxLDL, ×10-4 mol/L的苦参碱；④苦参碱中剂量组：培养细胞中加入终浓度为 mg/L的PMA, 100 mg/L的oxLDL, 5×10-4 mol/L的苦参碱；⑤苦参碱高剂量组：培养细胞中加入终浓度为 mg/L的PMA, 100 mg/L的oxLDL,1×10-3 mol/L的苦参碱，各组继续培养48 h. 按 文献 ［5］用荧光分光光度法测定各样品的胆固醇浓度，测定游离胆固醇时，反应液中省去胆固醇酯酶，胆固醇酯的含量用总胆固醇与游离胆固醇的差值获得. 按照MDA测定试剂盒说明书的方法，检测MDA的含量及活性. 显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色. 400倍光镜下非重复计数100个细胞，计出泡沫细胞所占的数量. 按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，提取的RNA溶于适量DEPC水中，备用. 逆转录总反应体系为50 μL,总RNA 10 μg, oligdT 2 μL,混匀短暂离心,70℃预变性10 min,冰浴5 min;加入MMLV逆转录酶2 μL, RNasin 1 μL, dNTP 2 μL, MMLV缓冲液10 μL 40℃逆转录60 min, 94℃ 5 min灭活逆转录酶. 荧光定量PCR引物序列资源自GenBank序列数据库. 根据基因的相对量=2-△△Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，△△Ct=［CtGI（待测样品）-CtGAPDH（待测样品）］-［ CtGI（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）］. GI是目的基因，校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量. 按文献方法［6］,待测样品用BCA试剂测定蛋白含量后蛋白浓度以BCA法测定. 采用BioRad Quantity 软件分析测定其区带的感光密度,以βactin为内参照,用目的片段与βactin的光密度比值表示蛋白质表达水平. 统计学处理: 各样本测定值以x±s表示，行方差分析(ANOVA)及多样本均数的两两比较(LSD). 组间方差不