核酸的物理化学性质 .pptxVIP

核酸的物理化学性质;(二)碱水解;(三)酶水解;1、核酸酶的分类;2、RNAase ★RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 ★牛胰核糖核酸酶(pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH :7、0-8、2 产物:3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一的内切酶 ★RNase T1 耐热、耐酸 产物:3′-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸,专一性更高 ★RNase T2 产物:将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾的寡核苷酸;3、DNase ★核酸酶S1 作用于单链DNA部分 ★牛胰脱氧核糖核酸酶,DNase I 切断双链或单链DNA,产物:以5′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★牛脾脱氧核糖核酸酶,DNase Ⅱ 产物:以3′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★DNA限制性内切酶 4、N-糖苷酶;二、? 核酸的酸碱性质;核苷酸的解离曲线;三、核酸的紫外吸收;1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1、8(1、65-1、85) 纯RNA的A260/A280应为2、0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1ABS值相当于:50ug/mL双螺旋DNA 或:40ug/mL单链DNA(或RNA) 或:20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大(增色效应) 在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小(减色效应);四、核酸的变性、复性及杂交;★变性因素: 热变性 酸碱变性(pH小于4或大于11) 变性剂(尿素、盐酸胍、甲醛) ★变性后的理化性质: 260 nm吸收值升高。 粘度降低,浮力密度升高。 二级结构改变,部分失活。;★DNA的变性是爆发式的,变性作用发生在一个特别窄的温度范围内。 DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度(Tm)。;影响DNA的Tm值的因素;;(二)复性;●1个核苷酸对(A、U),若浓度为Co=1、0mmol/L,则 50%复性时, Cot1/2=4×10-6mol、s/L,t=0、004秒 全部复性, Cot=10-4, t=0、1秒 ●E、coli 4、2×106碱基对,若浓度Co=1、0 umol/L,则 复性50%, Cot1/2=10 mol、s/L,t=107秒,约115天。 复性100%,Cot=500 mol、s/L,t=5×108秒,5758天。 ●依照复性动力学能够测定基因组的大小和重复序列的拷贝数;(三) 分子杂交;1、Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性(NaOH 0、5mol/L) 转膜(NC膜,尼龙膜) 固定(80℃,4-6h) 杂交(高盐浓度,68℃,几小时) Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列的大小和定位。 ;2、Northern Blotting 研究对象是mRNA,探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳(乙二醛、甲醛);;3、Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。;感谢您的聆听！