103细胞膜蛋白质的提取现代生物技术实验pre.pptxVIP

现代生物技术 课程展示细胞膜蛋白质提取——一个迷惑性的标题小组成员：杨睿 梁广楷 李 岩 邓运强第一部分 细胞膜结构特征蛋白质和磷脂是细胞膜的主要成分细胞膜结构膜蛋白包括整合膜蛋白（70%-80%）、外周膜蛋白、脂锚定膜蛋白整合膜蛋白膜蛋白种类膜蛋白包括整合膜蛋白（70%-80%） 外周膜蛋白 脂锚定膜蛋白整合膜蛋白膜蛋白种类整合膜蛋白疏水性强而溶解性差，易于聚集沉淀，膜蛋白丰度低，提取时容易被细胞中其他蛋白质污染导致难以分离第二部分 细胞质膜分离方法1 密度梯度离心法原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。密度梯度法通常情况下，研究者们会结合差速离心和蔗糖密度梯度离心进行细胞质膜的分离纯化，可以得到较高纯度的质膜蛋白质。1 密度梯度离心法举个例子粗提取细胞膜转移到sw-28管，加入50%蔗糖，添加匀浆缓冲液或50%的蔗糖混合物直到蔗糖浓度为44%。然后，梯度加入含有42.8%，42.3%，41.8%，41%，39%，和37%蔗糖。10万g离心6 h后取37%蔗糖处即为纯化细胞膜。密度梯度法Zhang, L. J., X. e. Wang, X. Peng, Y. J. Wei, R. Cao, Z. Liu, J. X. Xiong, X. f. Yin, C. Ping and S. Liang (2006). Cellular and Molecular Life Sciences 63(15): 1790-1804.不足：各种亚细胞器的密度之间存在重叠,因此通过这种方法得到的质膜一般存在其他亚细胞器,特别是来自内质网、线粒体的污染2 双水相法原理：相平衡：两个结构不同的水溶性聚合物水溶液可以形成一个双水相体系萃取：由于细胞膜和其它器膜与两相中多聚物的结合力不同，达到萃取分离这种结合力包括亲水亲油性、离子浓度、针对细胞膜糖蛋白的亲和性配体，甚至抗体等双水相法Schindler, J. and H. G. Nothwang (2006). PROTEOMICS 6(20): 5409-5417.2 双水相法举个例子Cao等人利用双水相法对蔗糖密度梯度离心后的样品进行进一步纯化,发现样品纯度得到了很大的提高,鉴定的结果中膜蛋白的比例达到67%双水相法Cao, R., X. Li, Z. Liu, X. Peng, W. Hu, X. Wang, P. Chen, J. Xie and S. Liang (2006). Journal of Proteome Research 5(3): 634-642.最近Sehindler和Nothwang也对双水相法应用于质膜蛋白质组学研究进行了综述，表明了它也是一个很有效的质膜纯化工具,并日益受到研究者的关注优点：提取效率高；提取的膜蛋白被污染的程度小；条件温和，膜蛋白不容易被破坏。不足：来自内质网、线粒体等亚细胞器的污染仍是一个存在的问题3 免疫磁珠亲和纯化法原理：根据膜表面的标志蛋白质对亚细胞器进行分离纯化，然后用已包被抗体的磁珠对细胞膜进行纯化（也有研究采用一抗、二抗法）免疫磁珠亲和法3 免疫磁珠亲和纯化法举个例子Lawson等使用抗体磁珠亲和纯化方法应用于大鼠肝瘤细胞系的质膜蛋白质的纯化,通过质谱鉴定发现此方法能得到高纯度的质膜蛋白质,而其中仅仅只包含了12%线粒体蛋白的污染免疫磁珠亲和法Lawson, E. L., J. G. Clifton, F. Huang, X. Li, D. C. Hixson and D. Josic (2006). ELECTROPHORESIS 27(13): 2747-2758.4 生物素和亲和素的特异性结合法背景：上述的质膜提纯的方法都是先将细胞或者组织破碎再进行纯化，但细胞破碎以后，质膜的特异性就降低了。考虑到质膜存在于细胞表面的特点，最近发展了在活细胞水平基础上的质膜纯化方法。 原理：先将活细胞与水溶性的生物素孵育，使表面质膜蛋白质标记上生物素；破碎细胞后，用含有凝集素的柱子或者磁珠纯化结合有生物素的膜或者蛋白。生物素结合法4 生物素和亲和素的特异性结合法举个例子 Zhao和Zhang等用这种方法将质膜蛋白富集400倍且污染少，可以得到很纯的整合质膜片段。经IDE-MS/MS分离与鉴定后，得到了898个蛋白质，其中781(87%)个有质膜定位，至少526(67%)个是整合质膜蛋白。生物素结合法Zhao, Y., W. Zhang, Y. Kho and Y. Zhao (2004). Analytical Chemistry 76(7): 1817-1823.缺点：活细胞状态下，生物素会发生内吞而造成细胞内细胞器的污染，同时有些蛋白质由于糖修饰等不能被生物素标记。5