β分泌酶原核表达载体的构建表达及融合蛋白纯化临床医学.docVIP

β分泌酶原核表达载体的构建表达及融合蛋白纯化临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：β分泌酶原核表达载体的构建表达及融合蛋白纯化临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨 论 5 文2：人CyclinE原核表达载体的构建及表达 6 1 材料和方法 7 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 β分泌酶原核表达载体的构建表达及融合蛋白纯化临床医学 文1：β分泌酶原核表达载体的构建表达及融合蛋白纯化临床医学 【Abstract】Objective To build mice β secretase prokaryotic expression vector and induce its expression and purification, to afford basis for β secretase research. Methods Primer was designed by mice β secretase gene cDNA in Genbank. cDNA segment of β secretase gene was amplified by RTPCR, then cloned into prokaryotic expression vector pET28a and traformed into E. coli BL21(DE3). After sequenced and identified, fusion protein was induced, expressed and Special β secretase gene segment amplified from RNA of mice brain tissue was 1 506 bp. After identified and sequenced, recombinant vector was proved correct, its fusion protein had a molecular weight of 55 kD. Electrophoresis purity target protein could be acquired. Conclusio Mice β secretase has a high expression in E. coli, which build a basis for research of β secretase′s biological function and its application. 【Key words】βsecretase; E. coli; Expression; Fusion protein 阿尔茨海默病(AD)是发病率最高，危害最大的中枢神经系统退变性疾病〔1〕。淀粉样斑块是其主要病理特征之一，主要成分β淀粉样蛋白(Aβ)在AD的发生、 发展 中起着重要作用，因此阻断或延迟AD早期Aβ的积聚成为 治疗 AD的切入点。β分泌酶(BACE)是淀粉样前体蛋白(APP)水解产生Aβ的关键酶，是干预AD进程的理想靶点〔2〕。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE在最近已见报道。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，不适合BACE抑制剂的大规模筛选〔3，4〕。而BACE的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究BACE结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。本研究利用大肠杆菌表达系统，选用pET28a作为表达载体获得小鼠BACE，经镍离子固定金属亲和层析纯化目的蛋白，以便进一步研究其功能。 1 材料与方法 主要材料 2月龄昆明小鼠(购自徐州医学院)；宿主菌 BL21(DE3)(由本实验室保存)；质粒pET28a(购自Novagen公司)；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol 试剂及AMV逆转录酶(美国Promega公司)；Pfu DNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNA marker、中分子量蛋白质marker是 Fermentas公司产品；镍离子亲合层析柱(Novagen公司产品)；其他化学试剂均为分析纯。 寡核苷引物的设计与合成 根据基因文库中小鼠BACE基因的cDNA序列及相应的限制性核酸内切酶位点设计合成2条引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)；P2:5′CGGAATTCT