白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制.docVIP

白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨论 5 文2：斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞株毒性作用的研究 6 1 材料与方法 7 2 结 果 9 3 讨 论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制 文1：白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制 第一李雨成(1967)，男，硕士，副教授，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病的研究。目前膀胱癌的主要 治疗 方法是以手术为主并配合术后化疗，常用的局部化疗药物主要为噻替派、丝裂霉素、阿霉素，局部免疫治疗药物为卡介苗、干扰素。从中药中筛选抗肿瘤药物为目前肿瘤药物治疗的一个热点。白花蛇舌草对许多株肿瘤细胞的增殖抑制作用已有报道〔1～4〕，但对膀胱癌EJ细胞株的作用尚不清楚。 1 材料与方法 材料 白花蛇舌草的乙醇提取物〔1，2〕 中药白花蛇舌草为购自本市中 医院 中药房的生药，取干燥生草1 kg完全浸泡在水中 h,分别煮、、 h，水煎后抽滤提取，并收集提取液3次，将3次提取液合并浓缩，并加入乙酸乙酯脱脂(1∶2)，取水相液加6倍乙醇(预冷)。水相液静置24 h后抽滤5次得深咖啡色粗多糖，并溶于二蒸水，用针式滤器抽滤后加入10%的RPMI1640完全培养基置于4℃冰箱待用 。 细胞来源 人膀胱移行细胞癌EJ细胞株(上海午立生物有限公司) 实验试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、荧光标记山羊抗兔IgG(FITC)(华美生物工程有限公司)，兔抗人TERT单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，北京中杉生物有限公司代理)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为Sigma公司) 主要设备 超净工作台(江苏省无锡市净化技术研究所华达净化设备厂)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，恒温培养箱(美国INK公司)，台式低温离心机(Sigma公司)，流式细胞仪(美国公司)，旋转蒸发仪(上海机械制造厂) 方法 细胞培养 人膀胱癌EJ细胞株。培养基为RPMI1640，内含10%的胎牛血清及10万U/L的庆大霉素，在37℃，5%CO2孵箱中培养，每3～4 d换液传代维持适当的细胞密度，%胰蛋白酶消化细胞。 实验分组 对照组不加白花蛇舌草提取物加一抗和二抗，每天更换RPMI1640培养液。实验组加白花蛇舌草提取物浓度分别为、、、 μg/L。接种细胞24 h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。空白组(MTT法不设空白组)不加白花蛇舌草提取物，加等量的PBS()代替一抗和二抗。 细胞毒性分析 用MTT比色法测定不同浓度白花蛇舌草提取物对EJ细胞增殖的影响并绘制剂量效应曲线。将细胞数为2×104/ml呈对数生长期的EJ细胞接种于96孔培养板中，于37℃含5%CO2孵箱中培养24 h，进入对数生长期后，将细胞分成实验组、对照组，实验组加不同浓度中药制剂，每个浓度设5个复孔；对照组加肿瘤细胞不加任何药物，为阴性对照。分别培养12、24、48、72 h后每孔加入MTT溶液20 μl,作用4 h后弃上清，每孔加入二甲基甲砜100 μl，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm波长处读取吸光度A值。 端粒酶的定量检测〔3，4〕 将对照组、实验组和空白组共同培养72 h。用%的胰蛋白酶消化后收集数量不少于1×106/ml细胞于1 ml Ep管中，共30个。4℃缓冲液离心洗2次(去上清)。4%多聚甲醛1 ml悬起细胞，室温孵育10 min，4℃缓冲液洗1次(去上清)。加甲醇1 ml/1×106/ml悬起细胞，室温孵育10 min。4℃缓冲液洗1次(去上清)。用%TristonX100 1 ml悬起细胞，PBS洗后4℃离心(去上清)。对照组、实验组加鼠抗人hTERT单克隆抗体(1∶200)稀释液100 μl混匀室温孵育30 min，4℃缓冲液洗1次(去上清)，空白组加等量的PBS。对照组、实验组加荧光标记的二抗山羊抗兔IgG(1∶200)稀释液100 μl悬起细胞,室温避光孵育30 min，用4℃缓冲液离心洗1次(去上清)。空白组加等量的PBS。%多聚甲醛250 μl悬起细胞，4℃冰箱保存，24 h内上机测试。 统计学处理 数据用x±s表示，应用单因素方差分析LSD检验的方法进行统计学分析。 2 结 果 肿瘤细胞生长抑制率 白花蛇舌草提取物作用于膀胱癌EJ细胞72 h后，细胞增殖受到明显抑制，且抑制效果随着时间和浓度的增加而