实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点.docVIP

______________________________________________________________________________________________________________ 等电点聚焦测蛋白质等电点 一．实验目的 1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理； 2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。 二．实验原理 等电点聚焦（ IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展， IEF 实质 就是在稳定的 pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质， 当加上电场后， 由于两性载体移动的 结果，在两极之间逐步建立起稳定的 pH 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存 在于这样的 pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最 终到达一个使其表面静电荷为 0 的区带，这时的 pH 则是这种分子的 pI 。聚焦在 等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于 pH 环境的改变，分 子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向 pI 迁移。因此，这些分子总是处于不 断地扩散和抗扩散的平衡之中，在 pI 处得以“聚焦。” 三．实验步骤 1.凝胶制备 按表 1 的比例配制 4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气 10min 。每组 4 管，每 管加胶液 1.8ml 。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中， 胶液加至离管顶部 1cm 处，在胶面上再覆盖 3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放 置 20～ 30min 即可聚合。表 1 凝胶工作液配比 凝胶母液（丙烯酰胺 30% ：甲叉双丙烯 1ml 精品资料 ______________________________________________________________________________________________________________ 酰胺 0.8% ） 10% 过硫酸铵 0.02ml 水 2.68ml 载体两性电解液 0.15ml 蛋白样品液 0.1ml,0.05ml TEMED 0.02ml 2.电泳 吸去凝胶柱表面上的水层， 将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。 于电泳槽下槽加 入 0.2 ％的 500ml 硫酸作正极；上槽加入 0.5 ％的 800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为 300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程， 故聚焦电泳过程中， 电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约 30min 后，停止电泳，全程约需 3h 。 3.剥胶 电泳结束后， 取下凝胶管， 用水洗去胶管两端的电极液， 按照柱状电泳剥胶的方 法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾，”正极端呈酸性，负极端呈碱性。 剥离后，量出并记录凝胶的长度。 4.固定 取其中的凝胶条 3 根置于一个小培养皿内，倒入 10% 放在三氯乙酸固定液中固 定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液 用直尺量出胶条长度 L1 和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度 L2。 精品资料 ______________________________________________________________________________________________________________ 5.pH 梯度的测量 切段法：将未经固定的 1 根胶条，按照从正极端 (酸性端 )到负极端 (碱性端 )的顺 序切成相等的 10 段，按次放人有标号的、装有 0.0lM 氯化钾的试管中，浸泡过 夜。然后用 pH 计测出每管浸泡液的 pH 并记录。 四．实验结果 1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置 凝胶条编号 1 2 3 4 固定前的长度 7.8cm 7.8cm 7.7cm L0 7.4cm 固定后的长度 7.7cm 7.8cm 7.4cm L1 蛋白带距酸端 1.3cm 1.4cm 1.3cm 未染色，测 pH 距离 L2 梯度 蛋白质距正极 1.32cm 1.4cm 1.3cm 实际长度 LS 2.pH 梯度表及其相应标准曲线 标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 长 度 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 /cm pH 3.05 3.72 5.04 6.76 7.24 7.99 8.62 9.58 10.1 10.1 值 4 8 精品资料 _____________________________________________________________________________________