氨基酸药物的发酵生产.ppt

2021/11/21 * L-Phe自水中结晶成白色叶片状晶体,无臭,微苦,pI为5.48;分解点为283～284℃。在25℃水中溶解度为2.96,在75℃水中为6.62,微溶于甲醇及乙醇,不溶于乙醚。1%水溶液pH为5.4～6.0。〔α〕25D为-4.47°（C＝0.5～2.0,在5mol／L HCl中）,〔α〕25D为-34.5°（C＝0.5~2.0,在水中）。 （2）酶拆分DL-Phe的原理:DL-Phe与醋酸酐反应生成乙酰-DL-Phe（Ac-DL-Phe）,氨基酰化酶可专一性水解Ac-L-Phe的酰胺键生成L-Phe,而不水解Ac-D-Phe酰胺键,再利用L-Phe与Ac-D-Phe在水中溶解度的差异进行分离。 Ac-D-Phe又可经消旋生成Ac-DL-Phe,再行水解和分离,如此反复进行,可将DL-Phe全部转化为L-Phe。DL-Phe拆分的基本反应过程如下: 2021/11/21 * （3）工艺路线 （4）工艺过程 ①固定化氨基酰化酶的制备 取DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如,G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）于去离子水中充分浸泡后,依次用10倍量0.5mol／L HCl和0.5mol／L NaOH溶液搅拌处理30min,再用去离子水洗至中性,然后依次用0.1mol／L及0.01mol／L的pH7.0磷酸缓冲液处理1～2h,滤干备用。 2021/11/21 * 另取培养40～50h的米曲扩大曲用6倍量去离子水分两次抽提,滤去残渣。滤液用2mol／L NaOH溶液调pH6.7~7.0,按100L酶液加1kg已处理的湿DEAE-SephadexA-50的比例混合,于0～4℃搅拌吸附4～5h,滤取DEAE-Sephadex A-50,依次用去离子水、0.1mol／L醋酸钠、0.01mol／L的pH7.0磷酸缓冲液洗涤3～4次,滤干得固定化氨基酰化酶,加1％甲苯后于冷库中贮存,备用。 ②Ac-DL-Phe的制备 将DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐按1∶7∶1（w／V／v）的比例加入反应釜中,90℃反应4～5h,回收醋酸,浓缩液加一定量去离子水,再浓缩至一定体积,冷却结晶,滤取结晶于60℃真空干燥得Ac－DL－Phe。 2021/11/21 * ③酶水解 在1000L反应罐中加700L 0.1mol／L Ac-DL-Phe钠盐溶液,搅拌下滴加6mol／L HCl至pH6.7～7.0,加15～20kg固定化氨基酰化酶,50℃反应4～5h,过滤,滤液待分离L－Phe,固定化酶再用于转化。 ④分离纯化 上述滤液用6mol／L HCl调至pH4.8～5.1,减压浓缩至35L左右,浓缩液于0℃结晶过夜,滤取结晶并用10L冷乙醇洗涤三次,抽干,于80℃烘3~4h,得L－Phe粗品。滤液和洗涤液合并后减压浓缩至20L左右,得Ac-D-Phe溶液,待消旋和再转化。 2021/11/21 * ⑤精制 取50L去离子水于100L反应罐中,加热至95~100℃,投入5kg L－Phe粗品,搅拌溶解,加药用活性炭0.25kg,搅拌脱色3min。趁热过滤,滤液转移至200L结晶罐中,冷却至40℃,加50 L 40℃ 95％乙醇,用6mol／L HCl调pH5.5,于0℃结晶过夜,滤取结晶,用10L冷乙醇洗涤3～4次,抽干,于80℃干燥3～4h。母液浓缩回收L-Phe结晶,所得结晶如上法重结晶一次,得药用L－Phe。结晶母液及洗涤液合并,减压浓缩后转入粗品母液,待消旋。 Ac－D－Phe的消旋 上述粗品及精品L-Phe母液及洗涤液合并后浓缩至60L,于100L反应罐中在搅拌下缓缓加入醋酸酐18.5L,在25～45℃搅拌反应30min,冷却至室温,放置6h,用浓盐酸调PH l.5～2.0,5℃结晶过夜,滤取结晶,用去离子水洗涤3～5次,每次20L,抽干,于40℃真空干燥得Ac－DL－Phe。 2021/11/21 * （5）检验 应为白色叶片状结晶,其含量应在98.5％～101.5％之间,〔α〕25D为-32.3°～+34.3°,1％水溶液pH为5.4～6.0,干燥失重应不超过0.3％,炽灼残渣应不超过0.4％,氯化物、硫酸盐及重金属均与异亮氨酸规定相同,砷盐应不超过1.5ppm,铁盐应不超过0.003%。 含量测定: （6）作用与用途 L-苯丙氨酸为复合氨基注射液的重要原料之一,也是合成苯丙氨酸 氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。 2021/11/21 * 四、化学合成法 ?（一）基本原理与过程 以α-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐、乙酰氨基丙二酸二乙酯、卤代烃、α-酮酸及某些氨基酸为