抗体制药pa (2)PPT课件2.ppt

第二节 单克隆抗体及其制备 1.抗原 动物体内 抗体 特异性差、纯度低产量低，反应不够灵敏 2. 抗原 动物体内 抗体 抗原不纯 抗体不纯 筛选单一效应B细胞 不能增殖，产生大量抗体 刺激 效应B 刺激 效应B * 第二节 单克隆抗体及其制备 动物免疫: 特定目标抗原 动物 脾脏中B淋巴细胞 B淋巴细胞大量繁殖 免疫 刺激 能分泌针对于该抗原的特异性抗体 目的： 在细胞融合后获 得尽可能多的分 泌针对于该目标 抗原的特异性抗 体的杂交瘤细胞 * 第二节 单克隆抗体及其制备 常用免疫方法： 常规免疫法 “稳妥；优势克隆” 脾内一次性免疫法 “省时；省抗原” 短程免疫法 “省时” 体外免疫法 “操作繁琐” 免疫途径： 皮下注射 腹腔注射 静脉注射 * 第二节 单克隆抗体及其制备 常规免疫法： * 第二节 单克隆抗体及其制备 脾内免疫法： 脾内免疫法即在麻醉条件下直接把0.1~0.2 ml的抗原注入脾脏进行免疫。脾内免疫法可提 高小鼠对抗原的免疫反应，节省抗原用量，细 胞抗原只需105个左右，可溶性抗原只需10μg 左右。 * 第二节 单克隆抗体及其制备 体外免疫法： 体外免疫法的优点很多，所需抗原量少，一般只需几微克，免疫期短，仅4~5天，干扰 因素少，已成功的制备出针对多抗原的单克 隆抗体，但融合后产生的杂交瘤细胞株不够 稳定。 * 第二节 单克隆抗体及其制备 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择 细胞融合方法： 病毒介导的细胞融合 PEG 介导细胞融合 电极融合 * 第二节 单克隆抗体及其制备 细胞悬液的制备与融合 ⑴ 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天 制备 ⑵ 骨髓瘤细胞悬液的制备： 于对数生长期制备 ⑶ 细胞融合：5% PEG （1000~4000），pH8.0， 38℃， 1min * 第二节 单克隆抗体及其制备 2. HAT培养基的筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 HT培养基 正常培养基 2 weeks later 1 week later * 第二节 单克隆抗体及其制备 三、筛选阳性克隆与克隆化 常用方法： 要求： 简便、快速、敏感； 在短时间能检测大量样品 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence， IFA） 放射免疫法（radioimmunoassay， RIA） 双向扩散法 * 第二节 单克隆抗体及其制备 酶联免疫吸附法（ELISA） 技术原理： * 第二节 单克隆抗体及其制备 四、克隆化 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 80 个细/96孔 饲养细胞（feeder cells） ELISA 法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清， 选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为 单克隆抗体。 * 第二节 单克隆抗体及其制备 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个 抗原决定簇----单克隆抗体（monoclonal antibody， MAb） 单克隆抗体优点： 高度纯一 高度专一 应用： 疾病的论断和治疗（生物导弹） 生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、定位很分离 * 第二节 单克隆抗体及其制备 五、单克隆抗体的大量制备 常用的大规模培养方法： 动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法 * 第二节 单克隆抗体及其制备 五、单克隆抗体的大量制备 大量制备单克隆抗体的方法主要有两种： 体外培养法：10μg/ml 动物体内诱生法：5~20mg/ml BALB/c小鼠 优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体较多且效价较高。缺点：混有杂蛋白 有血清培养法； 无血清培养法 * 第二节 单克隆抗体及其制备 * 第二节 单克隆抗体及其制备 动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法 * 第二节 单克隆抗体及其制备 * 第二节 单克隆抗体及其制备 * 第二节 单克隆抗体及其制备 六、单克隆抗体的纯化 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：