3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用发明专利.docxVIP

3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用 技术领域 本发明涉及放线菌培养制备化合物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤活性3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用。 背景技术 十字孢碱(STA)早于1977年从土壤中的放线菌的培养基中分离出来的一种吲哚咔唑类生物碱，此后的大量研究表明，其具有多种药理活性如抗肿瘤活性、抗菌作用、抑制血小板聚集等。最重要的是其具有广谱的蛋白激酶抑制活性，如对蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶(TPK)，细胞周期依赖性激酶蛋白等。但是由于其对于蛋白激酶的选择性差，而限制了对其的进一步研究。而随后发现的衍生物则呈现一定的抗肿瘤和蛋白激酶抑制活性，并且有多个进入临床试验阶段。如天然来源十字孢碱类衍生物UCN-01已完成和氟二氧嘧啶合用治疗转移性胰腺癌的临床Ⅱ期试验，其半合成得到的衍生物Midostaurin则在治疗FTL3突变急性髓性白血病(AML)临床研究取得了重大突破,并已经成功上市。合成十字孢碱类似物CEP-2563已经完成了治疗实体瘤的Ⅰ期临床研究，Enzastaurin作为选择性蛋白激酶β(PKCβ)抑制剂，正处于治疗淋巴瘤的Ⅲ期临床研究。从已经进入临床试验的十字孢碱类衍生物来看，该类化合物仍然具有进一步开发的前景，挖掘十字孢碱类衍生物，筛选出选择性较优的蛋白激酶抑制剂对于抗肿瘤如急性髓系白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、肝癌等以及激酶相关的肿瘤疾病，免疫类疾病如系统性红斑狼疮，眼部疾病如青光眼，神经性变性疾病如阿尔兹海默等新药研发具有重要的社会和经济意义。 发明内容 本发明提供了一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用，用大米发酵方法从放线菌Streptomyces sp.CICC 11026的发酵产物中制备得到，该化合物具有抗肿瘤活性和蛋白激酶抑制作用，可用于制备在蛋白激酶抑制剂类药物和抗肿瘤药物。 一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素，为式Ⅰ结构： 本发明式Ⅰ结构，提供一种具有抗肿瘤活性的3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，由放线菌Streptomyces sp.CICC 11026经大米发酵产生，再通过分离纯化得到，易于操作和实施。 一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，包括以下步骤： 1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到接种有放线菌的发酵培养基； 2)取步骤1)中接种有放线菌的发酵培养基，接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物； 3)将固体发酵产物分离纯化得到3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素。 步骤1)中，放线菌Streptomyces sp.CICC 11026采用中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)市售菌种，编号为11026，选购网址：/。 所述的摇床培养的条件为：20～35℃、100rpm～300rpm摇床培养2～5天；进一步，所述的摇床培养的条件为：25～30℃、150rpm～210rpm摇床培养3～4天。 步骤2)中，所述的大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，所述的大米、水与海盐之比为：40g：40mL～80mL：0.5g～3g。 所述的静置培养的条件为：23～33℃静置培养60～80天；进一步，所述的静置培养的条件为：25～30℃静置培养68～73天。 步骤3)中，所述的分离纯化包括：将固体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后常压凝胶色谱粗分离，得到混合组分；将混合组分通过中压制备液相分离，高效制备液相色谱分离纯化，得到本发明式Ⅰ结构的化合物。 所述的常压凝胶色谱粗分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系，体积百分数20％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为20：80，体积百分数100％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为100：0； 所述的中压制备液相分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液，体积百分数40％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为40：60，体积百分数100％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为100：0； 所述的高效制备液相色谱分离纯化的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-48％的乙腈-水溶液，体积百分数40％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为40：60，体积百分数48％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为48：52。 对本发明式Ⅰ结构采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，显示较强的细胞毒性，在激酶抑制实验中