Sanger测序流程分析和总结.pdfVIP

Sanger 测序 一、原理 Sanger 法测序是利用一种 DNA 聚合酶 来延伸结合在待定序列模板上的 引物 ，直到掺入一种链终止核 苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成， 每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP) ， 并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) 。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延 长的寡聚核苷酸选择性地在 G 、A 、T 或 C 处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以 A 、T、C 、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸， 然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测， 从而 获得可见的 DNA 碱基序列 。 ABI 3730XL 测序仪 是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可 同时分析 96 个样品 。该仪器 采用 4 色荧光同时检测 ，可不间断 24 小时运行， 自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数 据分析 。 二、技术路线 三、操作流程 1 、DNA 的提取 一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的 protocol ）。 2 、PCR 扩增与电泳 ① 配置 PCR 体系（ 25ul 体系） DNA 浓度大于 30ng/ul （DNA 浓度需要测定） : 试剂名称 用量 H2O 15.2 μl 10*PCR buffer 2.5 μl 2.5Mm dNTPs 3 μl primer （前后引物各 1ul ） 2 μl LA Taq 酶 0.3 μl DNA 模板 2 μl 注意 : 对于 CEBPA 和 NOTCH1 此类 GC 含量高的将 10*PCR buffer 2.5ul 换为 2*GC buffer 12.5ul , H2O 为 5.2ul 。 每次 96 孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（ 2000g 1min ）, 防止挂壁。 EP 管与 96 孔板等都为商 品型一次性产品 , 注意标记板号 , 样本号和引物号。 ② 设置 PCR 反应程序 一般程序： 96 ℃预变性 2min, 96 ℃ 30s, 57 ℃ 30s, 72 ℃ 2min, 35cycles; 72 ℃延伸 5min; 4 ℃/15 ℃∞。 CEBPA 和 NOTCH1 程序： 96 ℃预变性 5min, 95 ℃ 40s, 64 ℃/66 ℃ 40s, 72 ℃ 1min, 35cycles; 72 ℃延 伸 5min; 4 ℃/15 ℃∞。 ③ 琼脂糖凝胶电泳 配置 1.5% （60ml 0.9g, 大胶板 150ml 2.25g ）的琼脂糖凝胶 , 再分别取 2ul loading buffer 与 4ul DNA 扩增产物混合后进行电泳 , 160V 35min 。 3 、PCR 产物纯化 ① 配制消化液 TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶 0.5 μl TaKaRa Exonuclease I 外切酶 0.5 μl 配置消化液 , 分别取虾碱酶与外切酶 1:1 混合。 PCR 产物离心后，每个孔中加入 1 μl以上消化液到 PCR 反 应液中。 ② 纯化反应： 上 PCR 仪进行程序反应。 程序为 SAP: 37 ℃ 60min, 80 ℃ 15min, 4 ℃/15 ℃∞。 4 、测序反应 ① SEQ MI