免疫金标记技术 .ppt

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 免疫技术 试剂 标本 Ag Ab Ab Ag 标记免疫技术 试剂 标本 Ag* Ab Ab* Ag 放射性核素 荧光素 酶 化学发光剂 胶体金 标记物 技术 放射性核素 放射免疫技术 荧光素 荧光免疫技术 酶 酶免疫技术 化学发光剂 化学发光免疫技术 胶体金 金免疫技术 金免疫测定技术 金免疫组织化学染色技术 金免疫技术 斑点金免疫渗滤试验 金免疫层析试验 金免疫光镜染色技术 金免疫电镜染色技术 简介 胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒； 当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点(线); 从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。 金免疫组织化学染色技术 金免疫测定技术 制备 胶体金 制备 免疫金 建立 金免疫测定技术 胶体金的特性 胶体金（金溶胶）：是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。 胶体金的特性 胶体性质：稳定性、对电解质的敏感性 光吸收性和呈色性：胶体金的光吸收峰波长随颗粒的大小而变化。 稳定性：影响因素---电解质、溶胶浓度、温度、稳定剂 呈色性 不同大小的胶体金呈现不同的颜色 小颗粒--橙黄色 　中等颗粒—酒红色 较大颗粒—深红色 　大颗粒—紫色 胶体性质 稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮于液体中 胶体金 粒径（nm） 胶体金的制备 化学还原法:向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。 还原材料：氯金酸（HAuCl4) 还原剂：枸橼酸盐、白磷、硼氢化钠、维生素C。。。。 最常用的制备方法：枸橼酸盐还原法 操作要点 配HAuC4水溶液 加热 沸 枸橼酸三钠 搅动 加热 沸（约2～3min*）冷却 加蒸馏水至 原体积 * 见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后 很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定 成红色。 通过改变枸橼酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒 制备胶体金的注意事项 （1）玻璃容器必须是 最好是经硅 化处理的。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性 （3）氯金酸易潮解 （4）制备胶体金应用 或者是 高质量的去离子水。 ，不应使用金属药匙称量氯金酸。 双蒸/三蒸馏水， 绝对清洁的， ，应干燥、避光保存。 胶体金的鉴定和保存 鉴定 1、 清亮透明 2、金颗粒的大小 通过观察胶体金的颜色，粗略估计金颗粒的大小； 分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径 电镜观察 保存 保存于洁净的玻璃器皿中，室温或4°C，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。 优 质 劣 质 免疫金的特性 - - - - + + + + 胶体金 蛋白质 免疫金的制备 制备要点 PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱 蛋白质最适标记量的确定 标记过程 离心纯化：超速离心法 免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存 ：稳定剂-PEG，BSA 待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacl 最适标记量：能保持红色不变而蛋白含量最低的一管 蛋白量逐渐减低 对照管 金免疫测定技术— 固相膜免疫测定技术 固相载体：硝酸纤维素膜 标志物：胶体金 斑点金免疫渗滤试验（ dot immunogold filtration assay,DIGFA ），又称为滴金免疫测定法 金免疫层析试验 （ goldimmuno