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三磷酸腺苷二钠片微生物限度检查法验证研究 摘要：建立三磷酸腺苷二钠片的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果五种规定试验菌的回收率均不低于70%，可用于三磷酸腺苷二钠片的微生物限度检验。 关键词：三磷酸腺苷二钠片；微生物限度检查；方法验证 三磷酸腺苷二钠片是细胞代谢改善药。根据其制剂用药途径，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌—大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合2021年版《中国药典》二部附录?j有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。 1实验仪器和药物 1.1实验菌种 枯草芽孢杆菌CMCC（b）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（b）26003、大肠杆菌CMCC（b）44102、白色念珠菌CMCC（f）98001、黑曲霉CMCC（f）98003。 1.2样品：三磷酸腺苷二钠片：批号20211102 1.3培养基和稀释剂 营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（bl），改良马丁培养基，mug培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，ph7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。 培养箱、高压蒸汽灭菌器等。 2细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证 2.1细菌溶液的制备 取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。 2.2供试品溶液的制备方法 常规法：取样品10g，用ph7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液；取1：10的供试液1ml注皿。 2.3回收率试验 试验组：同2.2，另分别取各试验菌50～100cfu，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。菌液组：取试验菌50～100cfu注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数，平行制备2个平皿。 供试品对照组：同2.2，立即倒入琼脂培养基，凝固后设定规定温度，细菌培养24~48h，霉菌、酵母培养48~72h，测定供试品背景菌数。 2.4方法的确定 选择金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验。结果表明，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率分别为97%和93%，表明三磷酸腺苷二钠片对细菌和真菌无抑制作用。用常规方法测定细菌学、霉菌和酵母菌的数量是可行的。稀释剂无抑菌作用，不干扰实验。 2.5细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证 三批样品的验证试验结果表明，采用常规方法测定三磷酸腺苷二钠片中的细菌、霉菌和酵母数量 菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%，符合《中国药典》的规定，方法可行。确定三磷酸腺苷二钠片细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。 3控制菌试验方法的建立与验证 菌液制备同2.1。 3.1大肠杆菌检验方法 常规法：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100cfu，35℃培养24～48h。取培养物0.2ml接种至含5mlmug培养基的试管中，35℃培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝（emb）平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。 3.2大肠杆菌测试结果 经胆盐乳糖（bl）培养基培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果见表2。 根据以上实验结果，制定了三磷酸腺苷二钠片微生物限度检查标准。本文按照微生物限度检查法（附录J，第二部分，中国药典，2022版）进行微生物限度检查。 取本品10g，用ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。 取细菌、霉菌、酵母菌、大肠杆菌的1:10试液，采用常规方法，依法检查，应符合规定。 细菌数每1g不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数每1g