辣根过氧化物酶的提取纯化以及应用2讲课文档.pptVIP

现在一页，总共二十页。 优选辣根过氧化物酶的提取纯化以及应用 现在二页，总共二十页。 结构 反应机理 分离纯化 特性分析 应用 现在三页，总共二十页。 HRP的结构 辣根过氧化物酶同工酶 C是一条由 308个氨基酸组成的肽链 。在这条肽链中有 4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键 ,它们分别是 11～91、 44～49、 97～301和 17～209;同时还存在一个由 Asp99和 Arg123组成的盐桥。 现在四页，总共二十页。 HRP的结构 HRP C含有两个不同的金属中心:正铁原卟啉(即血红素 )和两个钙原子。这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。 通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与肽链上 His170侧链的 N原子结合 ,使血红素垂直连接在 His170上 (下图 ) ;而卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着的 ,当有 H2O2 存在时 ,该结合点就能与 CO、 氰化物、 氟化物或叠氮化物等小分子结合。 现在五页，总共二十页。 HRP C 的部分结构特征 现在六页，总共二十页。 HRP C 三维结构 现在七页，总共二十页。 HRP的结构 酶的结构总体上看来大部分是α螺旋 ,但其中也包含一些小的 β折叠。 在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域 ,该区域可能是由钙结合位点与其他结构元素共同作用而成的 ,也可能是基因复制后留下的产物。 现在八页，总共二十页。 HRP的结构 在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点 ,它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连。 每个钙原子都是 7供氧配合体 ,它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸 ,侧链上的 Asp、Ser和 Thr,以及一个末端结构水分子结合。 钙离子的丢失将会导致 HRP C酶失活和热稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改变。 现在九页，总共二十页。 HRP的作用机制 由 HRP催化的多数反应可由以下等式表示 ： AH +H2O2 →· A + 2H2O 其中 AH是还原性底物 , · A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物 ,酚类化合物 ,吲哚 ,胺类和磺酸盐。 现在十页，总共二十页。 　 HRP C 以阿魏酸为底物的催化循环 现在十一页，总共二十页。 催化循环的第一步是 H2O2 和静态酶中的 Fe(Ⅲ)反应生成化合物 Ⅰ(HRPⅠ) , HRPⅠ是一个高氧化态的催化中间体 ,包含一个含氧 Fe (Ⅳ)中心和一个带正电荷的卟啉。 由一分子还原性底物的加入HRPⅠ ,生成另一个含有含氧 Fe (Ⅳ)中心的催化中间体HRPⅡ。 由一分子还原性底物参加HRPⅡ ,使 HRPⅡ还原成静态酶。 图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应 ,包括形成二倍体、 三倍体、 多聚体 ,以及启动一个以该产物为底物的反应。 现在十二页，总共二十页。 辣根过氧化物酶的分离纯化 新鲜干净辣根 匀浆 尼龙纱布过滤 上清 40%-80%硫酸铵盐析 沉淀用水溶解并在水中进行透析 用-20℃丙酮制沉淀 离心，取上清 水溶解并透析 现在十三页，总共二十页。 辣根过氧化物酶的分离纯化 梯度洗脱 取第二个酶纯高峰部分在自来水中透析 上样于CM-23纤维素 上样于DEAE-52 取酶活高峰部分浓缩，既得 纯化辣根过氧化物酶 梯度洗脱 现在十四页，总共二十页。