基因工程第6章 DNA重组的操作1.pptVIP

4、动物细胞 早期：生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞 现在：体细胞培养 动物： 猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等 生产天然状态的复杂蛋白质 动物疫苗 动物品种的遗传改良 人类疾病的基因治疗 第二十六页，共六十三页。 第二节 重组体导入受体细胞 第二十七页，共六十三页。 2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation） 定义 转化微生物的种类 感受态细胞 P139 转化过程 供体（donor）：提供DNA的生物 受体（recipient or host）：获得DNA的生物 第二十八页，共六十三页。 1.定义 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。 2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928） 嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。 第二十九页，共六十三页。 3. 感受态（competence） 感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。 感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。 肺炎链球菌 对数生长后期 芽孢杆菌属 指数期末和稳定期 大肠杆菌 刚进入对数期 DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 第三十页，共六十三页。 大肠杆菌 革兰氏阴性菌 细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同 转化因子的吸收较为困难 人工制备感受态细胞 4. 转化过程 第三十一页，共六十三页。 大肠杆菌的转化方法： Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 第三十二页，共六十三页。 1、Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法 培养生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期 沉淀菌体 冰水浴中预冷10分钟，4 ℃离心 化合物处理 含CaCl2 无菌预冷缓冲液处理 DNA分子转化感受态细胞 第三十三页，共六十三页。 制备感受态细胞的注意事项 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或 －20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 第三十四页，共六十三页。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 第三十五页，共六十三页。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 第三十六页，共六十三页。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 第三十七页，共六十三页。 感受态细胞的制备 1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜 2、按1％的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状) 3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干 4、加入1mL 预冷的无菌0.1mol·L-1 CaCl2溶液涡旋，4℃下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清 5、沉淀以50-100μL 预冷的0.1mol·L-1 CaCl2重悬，4℃保存备用，7d内可用。 第三十八页，共六十三页。 细胞的转化 2ul重组DNA 50ul感受态细胞混匀 ＋ ↓ 冰浴30min 42℃热激90～120S ↓ ↓ 冰浴2min 复苏：加入450ul液态LB培养基，37 ℃轻缓振荡培养（150rpm），1.5～2h ↓ → 取30～50ul，涂布在含相应抗生素的培养基上，平板培养 挑取单菌落，于含相应抗生素的液态培养基培养后，取一定量提取质