Western_Blot详解及问题分析.pptVIP

编辑课件 膜解吸方法（膜的重复利用） 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。 Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）/thread-44929-1-1.html Western Blot常见问题分析 SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 SDS电泳 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 转移到膜上的蛋白很少 蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 原因 对 策 蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 背景太高 杂交信号很弱 抗体保存不当 抗原不充足 膜的漂洗过度 原因 对 策 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数 一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合 原因 对 策 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 出现非特异带 Further Readings 生物秀Western Blotting专题 /special/experiment/WesternBlotting.htm Millipore的蛋白印迹手册 /thread-45770-1-1.html Bio-Rad的western Blotting操作手册 /thread-30154-1-1.html Western blot问题解答专帖 /thread-40769-1-1.html 谢谢大家！ Western Blot 间接法基本原理：首先利用SDS对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。 We