第七章哺乳动物胚胎干细胞技术.pptx

韩 雪 蕾;主要内容;干细胞;全能干细胞 Totipotent stem cells ;多能干细胞 Multipotent stem cells ;专能干细胞 ;胚胎性干细胞 Embryonic stem (ES) Cells ;组织干细胞 Tissue-specific stem cell;一、胚胎干细胞的生物学特点;;2.来源： 囊胚的内细胞团（ICM） 早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。 ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚腔的内层生长，最后发育为卵黄膜； ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。 内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，肝脏，胰脏） 外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系） 其余的是中胚层 ;;3.细胞学特点 具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行 人为定向分化。 普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分化，能进行冷冻保存和遗传改造。 发育全能性： ;1）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下可形成内、中、外三种胚层细胞。 2）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种系混杂的集合体 ;3）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。 4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚胎发育，形成嵌合体。;4.功能 在滋养层细胞上或在含有分化移植因子的介质中，能维持未分化状态，并实现自我更新，因此可以无限增殖； 在体外，在诱导因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。 ;ES细胞具有种系传递（germline transmission）能力，能够形成嵌合体动物（chimeric animal）。 若在体外把ES细胞注射至另一胚泡内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。 ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种证明。 ;二、胚胎干细胞研究的意义;2.是研究细胞分化的理想手段 ES细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中维持不分化状态，当培养液中添加分化诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导分化为神经元和神经胶质细胞，DMSO诱导分化为平滑肌细胞等。 通过研究ES细胞的分化特点，可揭示细胞内信号转导的路径，发现新的信号受体，揭示细胞分化和调亡的机理。;;3.研究基因功能的首选细胞 由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱捕外源基因，因此进行基因敲除或定向插入外源基因的理想细胞。 用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细胞核移植技术获得的克隆后代，通过观察后代的表型变化，可探明未知基因的生物学功能和表达调控规律。;4.是生产转基因动物的主要方法之一 用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得嵌合体后代，用转染的ES细胞分化为生殖干细胞，生产转基因阳性动物。 也可把转化后的ES细胞作为供体核，用细胞核移植技术直接获得转基因动物。;;5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命 ; ;6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选 细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌物质诱发细胞癌变机理的理想材料； 在研究新药过程中，需要对药物的作用机理和药效进行研究，ES细胞在体外能分化多种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性强。;三 .胚胎干细胞的分离培养基本程序;小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚，;从胚泡中分离出细胞团的方法主要免疫外科学方法，显微外科学方法和组织培养法等。 其中组织培养法是将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，较易获得胚胎干细胞集落。 ;（1）免疫外科学方法：该法的原理是利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时