血清总胆红素和结合胆红素测定.ppt

* * 血清总胆红素和结合胆红素测定 燕 德 起 Biobase * 血清总胆红素和结合胆红素测定 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检测灵敏度提高。 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂】 1．咖啡因-苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解(加入咖啡因后不能加热溶解)，用去离子水补足至1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。 2．碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。 3．72.5mmol/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠5.0g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3个月。作10倍稀释成72.5mmol/L，冰箱保存，稳定期不少于2周。 4．28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。 5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。 6．5.0g/L叠氮钠溶液。 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂】 7．胆红素标准液 (1) 目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下： 收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小于0.04。 (2) 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在25℃条件下，光径1.000±0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系数应在60 700±1 600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74 380±866。 (3) 胆红素标准贮存液(171μmol/L) 准确称取符合要求的胆红素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇(勿用力摇动，以免产生气泡)。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4℃冰箱3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【操作步骤】 混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 标准曲线制作 混匀(不可产生气泡)，按总胆红素测定法操作。每一浓度作3个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【参考范围】 血清总胆红素：5.1～19μmol/L(0.3～1.1mg/dl)； 血清结合胆红素：1.7～6.8μmol/L(0.1～0.4mg/dl)。 【临床意义】 1．血清总胆红素测定的意义 (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。 (2) 肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。 (3) 新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。 (4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢性肾炎引起)，血清总胆红素减少。 Biobase * 改良J-G法测定血清总胆红素和结合