疏水层析实用.pptxVIP

会计学;反相层析： 与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力； 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相(降低极性)洗脱，方可见效。 洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性， 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质。 ;疏水层析 (所用基质的性能与反相层析不同)： 与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物容易被解析下来。 故，较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。 这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保持了其原来的结构和生物活性。 ;第一节 基本原理 ;亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)； 二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基； 三是:高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然不同的)。 ;一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起， 然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。 ;也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用 高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。 当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的 物质才会随后被洗下来。 （相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来 疏水作用强的物质随后被洗下来） 对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。 ;二、吸附剂; 1．亲水性吸附剂 基质主要是： 交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是： 苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂; 2．非亲水性吸附剂 基质有： 硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等 配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8???C18)等。 二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。 ;第二节 操作与应用 ; 3．装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。 ;二、加样与洗脱 ;三、应用实例 ;上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换层析）， 用梯度缓冲液(10mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl-1mmol／L EDTA-1mmol／Lα-巯基乙醇，盐浓度变化范围为0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱， 通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水层析。 此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯化钙调蛋白的流程见图4-1。;CaCl2