第八章蛋白质分析1上课讲义.pptVIP

优点 因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混合物中纯化的蛋白质。 1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。 B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。 2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。 4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。 缺点 由于下列因素，福林酚法在某些应用中需采用标准曲线进行校正。 1．反应产生的颜色比双缩脲法更易因蛋白质的种类不同而发生变化。 2．反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。 3．蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单糖和己胺会不同程度的干扰反应。 4.高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。 ? 四、紫外吸收法 原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基存在。由于存在于每一种食品的蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可用比色法，即在280nm处比色测定蛋白质的浓度。 适用范围 应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。 优点 快速，相对较灵敏（在280nm处需要100ug或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。 反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。 不破坏样品原有的性质，在测定完蛋白质含量后仍然可用于其它分析。广泛用于层析柱分离后的蛋白质测定。 缺点 核酸在280nm处也有紫外吸收，纯蛋白质和纯核酸的280nm/260nm紫外吸收比分别为1.75和0.5。如果知道280nm/260nm的值，就能校正核酸在280nm处的吸收值。 不同种类食品的蛋白质中，芳香族氨基酸的含量明显不同。 样品溶液必须纯净无色。 此法适用于相对纯净的体系。 Bicinchoninic Acid(BCA)法 原理 Smith等人提出,在碱性条件下蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子-蛋白质复合物和苹果绿的BCA试剂反应形成浅紫色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。 Bicinchoninic Acid(BCA)法 方法 1．蛋白质溶液和含有BCA钠盐、Na2CO3、NaOH、CuSO4、pH11.25的BCA试剂一步混合。 2．在37℃保温30min或室温下放置2hr,或60℃保温30min。温度的选择取决于灵敏度的要求。较高的温度导致较深的颜色反应。 3．在562nm处比色读数，并做空白比较。 4.用BSA作标准曲线。 Bicinchoninic Acid(BCA)法 优点 BCA法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。 1．灵敏度与福林酚法相似。微量BCA法的灵敏度（0.5~10ug）稍高于福林酚法。 2．一步混合的操作比福林酚法更简单。 3．所用试剂比福林酚法简单。 4．非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。 5．中等浓度的变性剂（4M盐酸胍或3M尿素）不对反应产生干扰。 Bicinchoninic Acid(BCA)法 缺点： 1．反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。 2．还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。 3．不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。 4．比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。 阴离子染色法 原理 含蛋白质的样品溶于缓冲液中和已知的过量阴离子染色剂混和，蛋白质与染色剂形成不溶性复合物。反应平衡后，离心或过滤除去不溶性的复合物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。 蛋白质 + 过量染色剂 蛋白质-染色剂复合不溶物 + 未结合可溶性染色剂 阴离子磺酸基染色剂，包括酸性十二号橙，橙G和酰黑10B，都可以和基本氨基酸残基中的阳性基团（组氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和赖氨酸中的ε-氨基等），以及蛋白质中游离的氨基酸终端基团结合. 未结合的染色剂与样品中蛋白质的含量成反比,可用分光光度计法测定。 方法 1．样品粉碎（60目或更小），加入过量的染色剂 。 2．剧烈摇晃内容物加速染色反应至平衡，过滤或离心去除不溶物。 3．测定滤液中未结合染色剂溶液的吸光度，从标准曲线中计算染色剂浓度。 4．通过对未结合染色剂浓度与样品的蛋白质总氮含量作图，得到一条线性的标准曲线。 5．与样品同类的未知样品的蛋白质含量可以根据标准曲线