高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因.docxVIP

高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、实验目的 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、实验原理 8 10 2 4咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学 名称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含 2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为 C H O N ， 8 10 2 4 H3C O CH3 N N O N N CH3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中 的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因 标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色 谱图上的保留时间 tR 和峰面积 A 后，可直接用 tR 定性，用峰面积 A 作为定量测定的参数，采用 工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100 高效液相色谱仪或上海通微 EasySepTM－1010 液相色谱仪。2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气 10min。 4、 000mg/L 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在 110℃下烘干 1h。准确称取 0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至 100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。 5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。 6、 平头微量注射器。 四、实验内容 1、 标准贮备液配制质量浓度分别为 20、40、60、80μg·mL-1 的标准系列溶液。 2、 谱仪器条件： 泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。 3、 仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。 4、 品处理如下：（1）将约 25mL 可口可乐置于一 100mL 洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌 30min 或用超声波脱气 5min，以赶尽可乐中二氧化碳。（2）准确称取 0.04g 速溶咖啡，用90℃蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取 0.04g 茶叶，用 20mL 蒸馏水煮沸 10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次，将茶叶全部转移至50mL 容量瓶中。将上述三种样品分别转移至 50mL 容量瓶中，并定容至刻度。 5、 上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。 6、 别取 5mL 可乐、咖啡饮料和茶叶水用 0.45μm 的过滤膜过滤后，注入 2mL 样品瓶中备用。 7、 “Agilent 1100 高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。 五、结果处理 测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。 确定未知样中咖啡因的出峰时间。 求取样品中咖啡因的浓度。 序号 序号 1 2 3 4 5 6 7 标样浓度μg· mL-1 20 40 60 80 速溶咖啡 茶叶可乐 保留时间 t 色谱峰面积 S 色谱峰高度 H R 六、注意事项 1、不同品牌的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。 2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。 3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。 思考题 1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？ 2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？ 3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什 么？ 4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？ 5、高效液相色谱柱一般可在室温进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也实行恒温，这又为什么？