基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术邻位连接延伸分析.pptVIP

主要内容 邻位连接分析技术（proximity ligation assay） 邻位延伸分析技术（proximity extension assay） CytoploRare ?技术 第一页，共二十六页。 一、PLA技术（邻位连接分析技术） 背景：瑞典ULF Landegren 研究小组2002年提出了一种新的蛋白体外分析方法----邻位连接技术(proximity ligation assay , PLA），通过一对亲和探针对目的分子双识别，继而产生可扩增的检测信号，从而将对蛋白质的检测转变成为对DNA 的检测，实现了微量蛋白的分析。是一种研究蛋白定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技术。 第二页，共二十六页。 PLA反应原理 1.当识别同一抗原上的两个抗体结合到抗原，则抗体上偶联寡核苷酸序列彼此靠近。 2.溶液中可以与这两个探针末端互补的连接片段的作用下，形成有一个断裂点的dsDNA片段。 3.在DNA连接酶的作用下形成完整的dsDNA。 4.以连接完整的DNA作为模板，进行定量PCR的检测；靶抗原的浓度与DNA模板的量成比例，进行蛋白定量转化。 第三页，共二十六页。 PLA基本过程 共分为3步： 孵育：样品与靶特异性抗体的一对邻位探针共孵育 连接：结合到同一蛋白上的邻位探针与连接片段杂交并发生邻位连接反应，形成一个环状的蛋白质一蛋白识别分子一单链DNA复合物 扩增：qPCR扩增复合物中的单链DNA部分 第四页，共二十六页。 PLA类型 PLA可分为三种：均相（液相）、固相和原位。 均相（液相），待测样品、探针、荧光PCR引物以及连接试剂加入同一管中进行荧光定量PCR，适用于微量蛋白质的快速检测。 固相，待测蛋白预先固定于微孔板上，洗涤去除未结合分子，去除游离探针，检测含量过低的蛋白。 原位，邻位探针与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结合，反应体系中加入的DNA短序列与探针上的DNA链互补，在连接酶的作用下形成环状DNA，RCA扩增。蛋白互作、细胞或组织内定位的PLA方法。 PLA 第五页，共二十六页。 PLA类型 根据抗体类型：直接PLA与间接PLA A图直接PLA，B图间接PLA，区别在于间接法用到的探针为二抗连接的亲和探针，一抗为捕获抗体。 第六页，共二十六页。 PLA技术检测蛋白的核心 邻位探针：不同的DNA单链与一对蛋白识别分子相结合形成，使其通过免疫吸附的方式结合到待测蛋白上。 为什么说PLA的核心是一对邻位探针？ 1.DNA与蛋白结合效率低。 2.通过筛选（指数富集配体系统进化技术SELEX）技术，难以得到与蛋白分子高特异性、高亲和力的核酸适体。 3.核酸适体的种类有限，难以满足PLA实验要求。 以上三个原因，限制了PLA的发展应用 第七页，共二十六页。 PLA探针的发展 探针的发展： 核酸适体：从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选出与靶分子特异性结合的小分子DNA。缺点：盲目、过程繁琐，核酸适配体种类有限。 化学法：多功能交换试剂SMPB：抗体与巯基修饰的单链DNA结合。 生物法：streptavidin与biotin高亲和力。 PLA探针已经走向商业化，Solulink公司可定做抗体DNA复合探针，可直接用于PLA反应。 第八页，共二十六页。 PLA国内外研究现状 国外：Olink公司在PLA方面做了较多基础研究，并对PLA技术申请了专利。相关产品：Dolink?（13000RMB）该技术平台于2015年12月被sigma-Aldrich公司收购，目前该产品正是该公司网站上的主推产品。 国内：目前处于实验室研究阶段，无相关产品 从2010年到2014年邻位连接技术的文献引用次数从41次到156次，到2015年关于PLA技术的报道为55篇。 第九页，共二十六页。 Olink公司PLA技术 Olink公司PLA技术应用领域 蛋白质互作及其修饰的检测 细胞蛋白定位分析 数字化定量 采用荧光染色，没有复杂判读标准，极有可能取代免疫组化 第十页，共二十六页。 Olink公司PLA 检测原理 蛋白In Situ （原位）检测 抗体偶联亲和探针为正负链，再加入与正负链两端同时互补的寡核苷酸序列（a，b），而这两条链在探针链上存在一个断裂点，在连接酶的作用，连接成为一个环状DNA。 以正链探针为引物，以环状DNA为模板，进行滚环扩增(RCA)，得到单链的串联PCR。 定量方法Olink 采用了终点定量的方法，加入荧光杂交探针，在荧光显微镜下检测。 第十一页，共二十六页。 PLA的应用举例 1. 检测稳定、瞬时和微弱的蛋白互作（