第八章酶的定向进化详解演示文稿.pptVIP

随机引物体外重组技术 以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。 第三十一页，共七十二页。 第三十二页，共七十二页。 基因家族重排技术 酶切 无引物PCR 第三十三页，共七十二页。 Crameri等人在实验中选用了4个1.6kb来自不同菌属但同样编码头孢菌素C酶的基因，它们之间具有58％～82％的同源性。用这4个基因分别或共同作为出发序列进行DNA改组，把同样的转化子涂在含有16～32ug/ml的拉氧头孢的平板上，经过多轮改组进化，分别得到对拉氧头孢由最高抗性的菌株。 第三十四页，共七十二页。 3. 突变体文库的构建 突变基因 突变体基因文库 表达载体 第三十五页，共七十二页。 3.1 文库质量要求 包容性：尽可能包含基因的任何一种可能的突变信息 完整性：尽可能完整反映基因的结构和功能信息，以便筛选得到具完整功能的进化酶 第三十六页，共七十二页。 表达载体： λ噬菌体载体系统：最早使用。适合大片段的克隆；转染率高，可达106以上；质量控制较好；适合长期保存。 质粒载体系统：体外操作简便，设计上具有很大的可塑性；能够实现对基因文库的功能型筛选。但：插入片段容量小，长片段再群体扩增时易丢失；转化效率较低；不能长期保存。 组装 第三十七页，共七十二页。 3.2 突变库的筛选 1.定向选择环境条件的设定 逐步改变调整所设定的环境条件 第三十八页，共七十二页。 2.高通量筛选 平板筛选 荧光筛选 噬菌体表面展示 酵母表面展示 核糖体展示 第三十九页，共七十二页。 平板筛选 依据重组细胞的表型，包括细胞生长状态、颜色变化情况、透明圈情况等进行筛选。 使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b -乳糖酶） 提高耐热性 易于观察的菌落表型（如菌落颜色等） 营养缺陷型的辅助筛选 第四十页，共七十二页。 噬菌体展示 根据所需要的特性，对经Shuffling后的DNA文库在噬菌体或细菌细胞表面（细菌、纤毛虫细胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底物亲和力的突变子。 第四十一页，共七十二页。 M13 phage 丝状噬菌体M13基因组是单链环状DNA 主要外壳蛋白是基因VIII编码的蛋白质 少量外壳蛋白是基因III、VI、VII和IX编码的蛋白 第四十二页，共七十二页。 丝状噬菌体的生活周期 第四十三页，共七十二页。 噬菌体显示筛选模式 第四十四页，共七十二页。 噬菌体显示的几种类型 第四十五页，共七十二页。 M13噬菌体pIII和pVIII的显示 第四十六页，共七十二页。 酵母双杂交展示 典型的真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不同结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。 前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。 第四十七页，共七十二页。 第四十八页，共七十二页。 4. 酶定向进化的应用 提高酶催化效率 改变底物特异性 改善酶的稳定性 获取具有新功能的酶 提高药用蛋白和疫苗的活性 第四十九页，共七十二页。 提高酶活力 L—天冬氨酸酶定向进化研究 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶 第五十页，共七十二页。 提高稳定性 T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃. 8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃ 第五十一页，共七十二页。 第八章酶的定向进化详解演示文稿 第一页，共七十二页。 优选第八章酶的定向进化 第二页，共七十二页。 天然酶的局限： 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非天然底物具有惰性 在非水环境下的低活力 对辅酶的依赖等 第三页，共七十二页。 能具备长期稳定性和活性 能适用