酶的分离纯化3.pptVIP

三、层析分离的原理 混合液中各组分的理化性质（分子大小、吸附力、亲和力、带电等）不同，固定相对不同组分的作用力(方式,大小等)不同，随着流动相相对于固定相运动,各组分在固定相上移动速度不同,从而彼此分离开来。 第六十页，共一百零九页。 四、基本操作过程(柱层析) 层析柱的准备 固定相材料的准备 装柱 平衡 上样 （洗涤和） 洗脱 收集洗脱液 洗脱液检测，绘制洗脱曲线 （柱再生） 下一轮上样 第六十一页，共一百零九页。 1、层析柱： 材料：玻璃或有机玻璃、钢管。 高径比（H/D）：100~150:1~20 2、固定相材料准备 筛选颗粒大小一致的组分→浸泡吸胀→淘洗去小颗粒 吸附剂：筛选→高温处理活化或酸碱处理去金属离子。 离子交换剂：HCl或NaOH交换处理，离子交换树脂用2~3倍于树脂体积的2mol/L，离子交换纤维素用0.5mol/L酸、碱处理。 第六十二页，共一百零九页。 3、装柱与平衡 垂直固定柱，然后干法或湿法装柱，再用2~3倍体积的上样缓冲液过柱，使柱床的离子强度与上样液一致，即所谓平衡。 4、上样（加样） 将样品细心加到柱床顶面，切勿冲动床面。 5、（洗涤）洗脱、收集和分析 洗涤是亲和层析的独特步骤，是用上样缓冲液过柱，将未被亲和吸附剂吸附的杂质淋洗出柱床的操作。 第六十三页，共一百零九页。 五、几种层析分离方法 （一）吸附层析 利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分分离的方法。 1、原理 2、吸附剂 的种类和特点 （1）种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。 第六十四页，共一百零九页。 （2）特点： ①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。 ②有些吸附剂使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强分离效果。 ③上样时低pH值和低离子强度，半小时后提高pH值和离子强度洗脱。 3、吸附的三个基本环节：加样、吸附、洗涤或洗脱。 第六十五页，共一百零九页。 4、洗脱方法： （1）溶剂洗脱法： （2）置换洗脱法： （3）前缘洗脱法： 第六十六页，共一百零九页。 （二）离子交换层析 1、原理 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种分离方法。 2、离子交换剂 （1）根据母体不同可分为 离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活 离子交换纤维素：最广泛的一类 离子交换凝胶：不耐高流速洗脱 第六十七页，共一百零九页。 根据活性基团性质不同可分为 阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶 -CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基） 阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶 -DEAE（二乙基氨基乙基）、-TEAE（三乙基氨基乙基） 3、离子交换反应 蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂。 第六十八页，共一百零九页。 4、操作要点 （1）装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。 （2）加样、平衡：1%~5%上样量。 （3）洗脱、收集：梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度）、梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）。 （4）再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。 第六十九页，共一百零九页。 第七十页，共一百零九页。 练习 1、下面哪一种不能作为离子交换剂用于分离纯化酶？（ ） A、DEAE-Sephadex B、CM-纤维素 C、TEAE-Sepharose D、Sephadex G50 2、某酶的等电点为6.8，若采用DEAE-纤维素进行离子交换分离，可选择下面哪种pH的缓冲液上柱？（ ） A、pH为5.0的缓冲液 B、pH为6.8的缓冲液 C、pH为8.0的缓冲液 D、都不行 第七十一页，共一百零九页。 （三) 凝胶过滤层析gel filtration chromatography 1、原理 利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同达到分离的目的。 2、常用的凝胶种类 （1）葡聚糖凝胶 Sephadex G-X X—表示每克干胶的吸水值的10倍 吸水值越大，分子量范围越宽 第七十二页，共一百零九页。 （2）琼脂糖糖凝胶 Sepharose 2B、4B、6B 2B、4B、6B表示琼脂糖含量为2%、4%、6%，浓度越高，凝胶网眼孔径越小，分布的大分子相对分子质量越小，范围越窄。 （3）聚丙烯酰胺糖凝胶 Bio-Gel P-2、4、6、…….、200、3