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全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响 1 1 对象与方法 2 17 统计分析 采用软件进行方差分析。 3 2 结果 3 3 讨论 4 文2：全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响 5 1 对象与方法 5 17 统计分析 采用软件进行方差分析。 7 2 结果 7 3 讨论 7 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响 文1：全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响 全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是近年来引起环境学者密切关注的新发现的持久性环境有机污染物，具有难溶性、生物蓄积性和沿食物链向高位营养级的生物体内富集的作用〔1〕。研究表明，PFOS可引起恒河猴体重减轻、血液多种生理生化指标异常、肝细胞空泡化等改变〔2〕。PFOS的污染已遍及全球生态系统〔3〕。本实验旨在对低剂量PFOS暴露条件下，大鼠脑组织中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的时间变化进行测定，探讨PFOS神经毒性作用机制。 1 对象与方法 11 试剂与仪器 全氟辛磺酸钾盐（瑞士fluka公司），用2%吐温-80配制。邻苯二甲醛、氨基酸标准品谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸（美国Sigma公司）。醋酸钾为分析纯，甲醇为色谱纯。高效液相色谱仪为HP HEWLETT PACKARD SERIES-1100（日本惠普公司）；C18色谱柱（150mm× 5μm）（美国Phenomenex公司）。超声波细胞粉碎机JY96-ⅡN（宁波新芝生物科技股份有限公司） 12 实验动物分组及处理 健康成年Wistar大鼠（中国医科大学动物实验中心）56只，体重190～220g，雌雄各半。随机分为5组，1个对照组（2%吐温-80溶液）和4个实验组PFOS染毒［25mg/(kg·bw)］，每组8只，经口灌胃染毒1次。染毒2，4，8，24h后采集脑组织，经2%戊巴比妥钠麻醉后，按设定时间将大鼠颈静脉放血处死，迅速断头，开颅取脑，在冰皿上分离脑组织，分别测定2，4，8和24h大鼠脑组织氨基酸含量。 13 样品制备 将分离的脑组织用预冷的生理盐水1∶9（w/v）匀浆5min，在冰水浴条件下超声脑组织，3500min，4℃离心20min，取上清100μl用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。另取上清1ml 10000min，4℃高速离心20min后，取其上清，以备氨基酸测定。 14 考马斯亮蓝法测定脑组织蛋白质含量 称取10mg小牛血清蛋白，溶于蒸馏水中，分别稀释配制成，，，，1mg/L的标准品。分别取100μl待测样品加入考马斯亮蓝5ml，722分光光度计比色，测定待测样品中的蛋白质含量以备标定氨基酸。 邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色谱荧光法检测氨基酸含量 标准液配制：分别用1mol/L 氢氧化钠溶液配制谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸标准品1mmol/L的储备液，临时用1mol/L 氢氧化钠稀释配制成，，，，1，5，10，100μmol/L的标准系列。衍生试剂配制：称取20mg邻苯二甲醛， β-巯基乙醇溶于甲醇中；再加入9ml /L硼酸缓冲液(pH为); 超声溶解，新鲜配制，避光保存。衍生化反应：在室温下，吸取氨基酸标准液或样品液100μl，1mol/L氢氧化钠溶液100μl，加入邻苯二甲醛衍生试剂400μl，混匀静置2min后，进样30μl。 16 色谱条件 色谱柱：C18色谱柱（150mm× 5μm），柱温为28℃。流动相A：/L醋酸钾溶液，pH=。流动相B：HPLC级甲醇。B相梯度洗脱条件：0～10min 10%→25%；12～19min 47%→60%；22～27min 100%→100%，28min 10%，平衡5min，30min结束洗脱。用安捷伦色谱工作站记录并分析结果，峰面积用外标法定量。荧光检测器，激发波长250nm，发射波长410nm。 17 统计分析 采用软件进行方差分析。 2 结果 21 行为观察 PFOS染毒组大鼠在染毒2h后出现活动减缓，少动呆卧，嗜睡，24h后活动恢复正常。对照组未见异常改变。 22 色谱行为 在上述色谱条件下，标准液及大鼠脑组织中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸均得到良好分离。 不同PFOS急性染毒时间脑组织氨基酸含量变化比较（表1） 表1 PFOS暴露时间大鼠脑组织氨基酸含量的比较（略） 注：与对照组比较，*