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邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制 1 1 材料与方法 2 13 动物来源及染毒方法 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制 7 1 材料与方法 7 13 动物来源及染毒方法 8 18 统计方法 采用SPSS110软件，进行方差分析。 10 2 结果 10 3 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制 文1：邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制 近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被认为是一种环境内分泌干扰物，主要表现为雄性生殖发育毒性(染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂等)〔1，2〕。本研究以DBP为邻苯二甲酸酯类(phthalates)的代表物，观察DBP对发育过程中F1代幼鼠睾酮(T)水平和雄激素结合蛋白(Androgen-binding protein，ABP)、抑制素(inhibin)、苗勒氏管抑制物质(MIS)基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑-垂体-性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。 1 材料与方法 11 试剂 DBP(分析纯，纯度≥995%，上海溶剂厂)；吐温-80(化学纯，符合Q/CYDZ-162-97，中国医药集团上海化学试剂公司)；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)；单克隆兔抗带状闭合蛋白1(zona coclude1)，ZO1)抗体(美国Zymed Laboratories公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC山羊抗兔IgG)(北京中山生物医学有限公司) 12 剂量设置及试剂配制 共设3个染毒组，DBP染毒剂量依次为50，200，1000mg/kg。另设1个溶剂对照组(0mg/kg)。准确称取100g DBP置入干净的烧杯中，按1∶2比例加入吐温80和精制植物油，定容至500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组，溶剂对照组用1∶2的吐温80和植物油加蒸馏水配制而成，其中吐温80和植物油的用量同高剂量组。 13 动物来源及染毒方法 131 实验动物 SPF级Sprague-Dawley大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，沪动合格证字152号，，雌性100只，体重(200±20)g，雄性50只，体重(300±30)g。 132 饲养条件 清洁级动物房，温度为(22±3)℃，相对湿度为50%～60%，人工照明，12h光照，12h黑暗。动物食用标准颗粒饲料，自由饮水。 133 染毒方式 孕鼠灌胃染毒，自妊娠第1d(gestation day 1，GD1)至哺乳期结束〔出生后21d(postnatal day 21，PND21)〕，每天1次，灌胃容积为05ml/(100g·bw)。停止染毒后，F1代雄鼠饲养至性成熟期PND70d。 134 实验设计 清洁级SD成年大鼠，适应性饲养1周后，按1∶2比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天清晨固定时间做阴道涂片，显微镜下查涂片上有无精子以确定是否受孕。查到精子后，将受孕大鼠取出，按体重随机分配至4个实验组，查到精子的当天确定为妊娠第0d(GD0)。2周交配试验结束后，弃去雄鼠和未怀孕的雌性大鼠，每个实验组由20只怀孕母鼠组成，自受孕第2d(GD1)开始，灌胃染毒至哺乳期结束(PND21)；每天称重一次，并根据体重调节染毒容积；出生后4d(PND4)按照欧洲经济合作与发展组织(OECD)实验指南()要求〔3〕，为保持仔鼠营养的均衡性，进行窝标准化操作，即保持每窝8只仔鼠(4只雌鼠，4只雄鼠)，不足8只的窝剔除，这样对照组、低剂量组和中剂量组各有16窝，高剂量组有14窝。F1代雄性仔鼠出生第1，4和21d，每组选取5只动物，无菌环境中，迅速取下睾丸组织，立即置于放在干冰上的无酶离心管中，-70℃保存至RNA抽提。 14 血清睾酮水平的测定 采用ELISA方法测定PND70d大鼠的血清睾酮水平，睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)，按试剂盒说明进行操作。 15 RNA的提取 用TRIzol试剂一步法提取睾丸组织总RNA。 16 RTPCR引物 根据Genebank中SD大鼠的RNA序列，用Primer5引物设计软件自行设计ABP、Inhibinα和MIS的引物序列。βactin(470bp):Sequenc