过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染.docVIP

过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染 1 1材料和方法 2 文2：过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染医学论文 4 1材料和方法 5 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 9 正文 过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染 文1：过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染 0引言 我们已构建了幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， ）黏附素保守区AB和过氧化氢酶的高效原核表达体系［1，2］，表达产物经过纯化后在体外探讨了它的安全性、免疫原性和生物活性［3］. 现通过建立感染的小鼠模型观察过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗感染的作用，为治疗性疫苗的研制奠定基础。 1材料和方法 材料 幽门螺杆菌ss1株为本所保存，无特定病原体（specificpathogen free， SPF）C57BL/6小鼠140只，4 wk龄，雄性，体质量12~13 g，饲养条件符合2级动物要求. 重组黏附素保守区rAB、过氧化氢酶、快速尿素酶试剂由本所制备；其余试剂为国产分析纯. 的固体培养：取冷冻保存的菌种一环于固体培养基上连续划线接种，2 h内置厌氧培养箱，37℃微需氧环境（50 mL/L O2， 100 mL/L CO2， 850 mL/L N2）中培养72 h，湿度保持95％以上. 的菌落呈园形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直径~ mm左右. 液体培养：取固体培养基上生长的菌落至布氏肉汤中，抽滤瓶抽气换气2次以满足微需氧条件，恒温振荡培养120 min培养48~72 h. 的鉴定包括菌落形态、涂片观察（包括革兰染色观察细菌形态、暗视野观察细菌活力）、尿素酶实验（将自制尿素酶试剂加入含鼠胃组织的96孔板各孔中， 37℃作用5 min，当有感染时试剂由黄色变为红色）. 灌胃用的要求：革兰染色阴性，形态呈S形、螺旋形、杆状，暗视野下有活力，不含杂菌，密度约为1×1012/L。 感染小鼠模型的建立:采用文献［4］方法驯化 ss1株，分离可在小鼠胃内稳定定植的 ss1株，固体培养2~3 d，菌落经鉴定后用布氏肉汤洗下，调整细菌浓度至1×1012 CFU/L，每只小鼠灌胃 mL（约1×1012/L）. 所有动物灌胃前禁食12 h，禁水4 h. 灌胃后禁食2 h. 连续5次，1 wk完成. 采用胃管法以确保灌入胃内. 末次灌胃后4 wk随机处死5只小鼠，剖腹取胃，沿纵轴将胃切为3部分，一份行快速尿素酶试验，一份置40 g/L甲醛固定供组织学检查，一份细菌培养，检查是否感染。 方法 将已鉴定感染的小鼠随机分成7组：①二价疫苗组：经口喂饲过氧化氢酶和黏附素保守区各100 μｇ加ＣＴ 2 μｇ；②单价过氧化氢酶疫苗组：经口喂饲过氧化氢酶100 μg加ＣＴ 2 μｇ；③单价黏附素保守区疫苗组：经口喂饲黏附素保守区100 μg加ＣＴ 2 μg；④单纯过氧化氢酶组：经口喂饲过氧化氢酶100 μｇ；⑤单纯黏附素保守区组：经口喂饲黏附素保守区100 μｇ/次；⑥单纯CT组：经口喂饲ＣＴ 2 μｇ；⑦PBS组：经口喂饲PBS 200 μL/次. 前3组为治疗组，每组28只小鼠；后4组为对照组，每组10只小鼠. 免疫治疗前小鼠禁食12 h，禁水4 h. 每只小鼠先用30 g/L碳酸氢钠100 μL灌胃以中和胃酸，10 min后分别按上述分组灌胃，30 min后再给小鼠提供水和食物. 隔周免疫，加强免疫3次，剂量同前. 末次免疫后4 wk，禁食1 d，摘眼球放血处死动物，用750 g/L乙醇浸泡小鼠体表5 min以上. 在超净工作台内迅速取出胃用于免疫治疗后幽门螺杆菌根除的鉴定，方法采用半定量细菌培养法［5］，胃组织称质量后，制成匀浆，用布氏肉汤倍比稀释后，取200 μL涂于Hp固体培养基，菌落计数后，计算单位胃组织的定植细菌密度。 统计学处理：采用SPSS 软件，计数资料行χ2检验，计量资料的比较采用方差分析，P 2结果 经尿素酶实验、组织病理学检查（Fig 1）及细菌培养证实5只随机处死的小鼠全部感染. 细菌培养发现胃组织的定植密度为1×105~1×106/g。 胃组织培养为阴性者定为根除，疫苗治疗组根除率显著高于其他4组（P 3讨论 疫苗不单具有预防作用，同时还有治疗作用. 用重组尿素酶加上佐剂大肠杆菌不耐热毒素（LT）口服免疫已感染的恒河猴，大多数动物胃内得到根除且胃炎明显好转［6，7］；免疫治疗已成为治疗感染最有效、最有前景的方法之一. 同时也提示单一尿素酶抗原免疫不能达到最佳的治疗效果，为了