蛋白质分析法.ppt

蛋白质分析法 蛋白质纯化 蛋白质测序 分子量的测定 X－射线晶体学与核磁共振 功能分析 蛋白质折叠 蛋白质组学 蛋白质芯片 蛋白质纯化 为了研究某一种蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来 用于分离蛋白质的最重要的依据 分子大小 电荷 疏水性 亲和性 重组技术 凝胶过滤 原理：依据蛋白质分子大小的分离方法 电泳 原理：依据蛋白质带净电荷量不同从而在电场中移动速度不同而分离开来 亲和层析 原理：依据亲和性进行分离，如酶与底物、受体与配体和抗原与抗体反应。 重组技术 在一个适合的宿主细胞中过量表达重组蛋白质，产量的提高大大简化纯化过程 通过在基因的5’或3’端加入6个组氨酸密码子，形成纯化的标签，可进一步加速纯化进程，这使得含有固定金属离子如可与组氨酸结合的Ni2+的亲和柱上 标签通常对蛋白质的功能没有什么影响 蛋白质测序 蛋白质在测序之前首先需要经过水解，得到小肽，然后用自动蛋白质测序仪用Edman降解法测定氨基酸序列 蛋白质分子质量的测定 依据凝胶过滤层析将样品蛋白质洗脱时间与已知标准蛋白的洗脱时间相比可给出样品蛋白的近似分子量 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于确定单个肽链的大小 质谱测定极为精确但上限仅几kDa且对蛋白质是破坏性的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 X-衍射晶体学和核磁共振 X-晶体衍射——X射线可与蛋白质中的电子作用得到特有的衍射图谱，可用于确定晶体中原子的位置 功能分析 基于氨基酸一级序列信息，利用计算机辅助方法进行蛋白质三维结构预测。 同源性分析氨基酸序列具有明显的相似性,这种相似性称为序列同源性。具有序列同源性的蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白共有的相似序列称为共义序列。 遗传分析可揭示该蛋白质在细胞中的作用－某一蛋白质的基因可通过突变失活或用重组DNA技术删除，进而研究其突变体的表现型，揭示该蛋白质的作用 蛋白质折叠 蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题。研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。 大家都知道的疯牛病，它是由一种称为Prion的蛋白质的感染引起的，这种蛋白质也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中，Prion是正常神经活动所需要的蛋白质，而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构不同。这一疾病的研究涉及到许多生物学的基本问题。一级结构完全相同的蛋白质为什么会有不同的空间结构，这与Anfinsen原理是否矛盾？显然这里有蛋白质的能量和稳定性问题。  蛋白质组学 Proteomics is the systematic study of all of the proteins in a cell, tissue, or organism. proteomics has been used to identify hundreds of proteins in the ovary, prostate, breast, and esophagus that increase or decrease as cells begin to grow abnormally. 蛋白质组学数据库 蛋白质芯片的定义 蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 蛋白芯片的分类 蛋白质微阵列 　　　通过点样机械装置制作蛋白质芯片，将针尖浸入装有纯化的蛋白质溶液的微孔中，然后移至载玻片上 微孔板蛋白质芯片 　　　利用机械手在96孔的每一个孔的平底上点样成同样的四组蛋白质，每组36个点(4×36阵列)，含有8种不同抗原和标记蛋白。可直接使用与之配套的全自动免疫分析仪，测定结果。适合蛋白质的大规模、多种类的筛选。 三维凝胶块芯片 　　　是在基片上点布以10000个微小聚苯烯酰胺凝胶块，每个凝胶块可用于靶DNA、RNA和蛋白质的分析。这种芯片可用于筛选抗原抗体、酶动力学反应的研究。该系统的优点是：凝胶条的三维化能加进更多的已知样品，提高检测的灵敏度；蛋白质能够以天然状态分析，可以进行免疫测定、受体、配体研究和蛋白质组分分析。 蛋白质芯片的应用 用于基因表达的筛选 　　　从人胎儿脑的cDNA文库中选出92个克隆的粗提物制成蛋白质芯片，用特异性的抗体对其进行检测，结果的准确率在87％以上 用于特异性抗原抗体的检测 　　　蛋白质芯片上的抗原抗体反应体现出很好的特异性，在一块蛋白质芯片上10800个点中，根据抗原抗体的特异性结合可检测到唯一的1个阳性位点。 生化反应的检测 　　对酶活性的测定一直是临